| Mobile | RSS

اصول‌ و مبانی PCR

آبان ۱ام, ۱۳۹۰ | ۲ Comments | Posted in وسایل و ابزارها

واکنش های pcr

+ Polymerase Chain Reaction
 
(PCR (Polymerase Chain Reaction
 
تکنیکی است که به طور گسترده ای در بیولوژی مولکولی به کار برده می شود. این تکنیک نام خود را از یکی از ترکیبات کلیدی خود، DNA پلیمراز ، که جهت تهیه تعداد بسیار زیادی از کپی از یک رشته DNA مورد نظر بکار گرفته می شود؛ می گیرد. با ادامه روند PCR از تعداد کپی های اولیه یک قطعه DNA، که ممکن است تعداد بسیار کمی باشند، به عنوان الگو استفاده شده و به میزان بسیار زیادی در حد چندین میلیون کپی تولید می گردد. که محصول نهایی PCR را به طور کلی Amplicon می گویند. که همان ماده تقویت شده است. امروزه روش ‏PCR‏ جایگاه بسیار مهمی را در جنبه‌های مختلف مهندسی ژنتیک، بیولوژی مولکولی، میکروب‌شناسی تشخیصی، تشخیص سرطان و بیماری‌های ژنتیک، تشخیص هویت، جرم شناسی (پزشکی قانونی جهت تشخیص منشأ نمونه اسپرم، خون) وتعیین ترادف، باستان‌شناسی، مطالعات تکاملی موجودات و … پیدا کرده است.
 
واکنش‌ زنجیره‌ پلی‌مراز PCR
    ‌‌‌‌مسئله‌ اصلی‌ در بررسی‌ یک‌ ژن‌ خاص‌ مشکل‌ هدف‌ گیری‌ آن‌ در یک‌ ژنوم‌ پیچیده‌ که‌ ممکن است‌ بیش‌ از صد هزار ژن‌ داشته‌ باشد است. بسیاری‌ از روشها در ژنتیک‌ ملکولی‌ به‌ این‌ مشکل‌ فائق ‌آمده‌اند. تکنیک PCR  در اواسط‌ دههِ ۱۹۸۰ در دپارتمان‌ ژنتیک‌ انسانی‌ بوسیلهِ Karu Mullis ابداع‌ و برای‌ تکثیر ژن‌ کم‌ خونی‌ داسی‌ شکل‌ و بتاگلوبین‌ انسانی‌ مورد استفاده‌ قرار گرفتSaiki(1985) از پژوهشگران‌ شرکت‌ مهندسی‌ ستوس اشکالات‌ موجود را رفع‌ کرد وروش متداول‌ کنونی‌ را ابداع‌ نمود. حقوق‌ تجاری‌ این‌ اختراع‌ اینک‌ به‌ شرکت‌ هافمن‌ – روچت تعلق‌ دارد Karu Mullis در سال‌ 1993 موفق‌ به‌ کسب‌ جایزهِ نوبل‌ شیمی‌ گردید. واکنش‌ زنجیرهِ پلی‌ مراز یک‌ روش‌ آزمایشگاهی‌ است‌ که‌ به‌ منظور تولید انبوه‌ قطعه‌ خاص‌ و انتخابی‌ از DNA به‌ کار می‌رود.‌‌‌ واکنش‌ مبتنی‌ بر تکثیر آنزیمی‌ قطعه‌ای‌ از DNA است‌ که‌ با استفاد از دو آغازگر چند نوکلئوتیدی‌ که‌ مکمل‌ پایانهِ َ۵ هر دو رشته‌ مورد نظر هستند، صورت‌ می‌گیرد تا کپی‌ شدن‌ الگوی‌ DNA توسط‌ آنزیم‌ پلیمراز امکان‌پذیر شود در سال‌ 1985 تنها سه‌ مقاله‌ علمی‌ در زمینه PCR ‌گزارش‌ شده‌ بود. پنج‌ سال‌ بعد از آن‌ این‌ روش‌ در هزاران‌ آزمایشگاه‌ استفاده‌ گردید و تاکنون‌ هزاران ‌مقاله‌ و دهها کتاب‌ مستقل‌ به‌ این‌ موضوع‌ اختصاص‌ داده‌ شده‌ است‌ به‌ گونه‌ای‌ که‌ دانشگاه‌ آکسفورد حتی‌ مجله‌ای‌ به‌ نام PCR  منتشر می‌سازد .
‌‌‌‌به‌ عقیده‌ بیولوژیستها PCR وسیله‌ای‌ است‌ که‌ سوزنی‌ را در کوهی‌ از کاه‌ پیدا می‌کند PCR . از نظر اصولی‌ عملی‌ تشابه‌ زیادی‌ به‌ همانند سازی DNA  دارد و در واقع‌ برگرفته‌ از آن‌ است‌ بطور کلی‌ دو فرق‌ بین PCR  و همانندسازی‌ وجود دارد: همانند سازی‌ در بدن‌ در دمایc 37 با آنزیم‌ DNA پلی‌ مراز و آنزیمهای‌ دیگر صورت‌ می‌گیرد در PCR به‌ علت‌ نیاز به‌ درجه‌ حرارت‌ بالا جهت‌ واسرشت‌ شدن‌ از آنزیم‌ مقاوم‌ به‌ حرارت‌ همانند Taq استفاده‌ می‌شود و به‌ جای‌ سایر آنزیمها ازتغییرات‌ درجه‌ حرارت‌ استفاده‌ می‌شود.
مقایسه‌ تکثیر ژن‌ از طریق‌ کلونینگ‌ با PCR 
– در کلونینگ‌ هفته‌ها یا ماهها وقت‌ برای‌ تکثیر قطعه DNA لازم‌ است، در حالیکه‌ در PCR قطعات‌ خاص DNA از ژنومی‌ پیچیده، ظرف‌ چند ساعت‌ بدست‌ می‌آید.
– ‌‌‌‌در PCR مقادیر بسیار کمی‌ از DNA برای‌ تکثیر مورد نیاز است‌ درحالیکه‌ در روشهای استاندارد کلونینگ‌ و تجزیه‌ وتحلیلهای‌ بیولوژی‌ ملکولی‌ به‌ چند میلیون‌ قطعه‌ از DNA احتیاج‌ است.
 – برای‌ کلون‌ کردن، DNA تا حد امکان‌ باید خالص‌ باشد ولی‌ برای PCR خلوص DNA اهمیت‌ زیادی‌ ندارد 
– تکثیر DNA در PCR در محیط‌ عاری‌ از سلول‌ صورت‌ می‌گیرد ولی‌ کلونینگ‌ به‌ سلولهای زنده‌ نیاز دارد.
– یکی‌ از مزایای PCR سرعت‌ آن‌ است‌ پلیمراز Taq می‌تواند توالی‌هایی‌ متجاوز از هزار جفت‌ باز را در ظرف‌ مدت‌ کمتر از یک‌ دقیقه‌ تکثیر نماید.
– در PCR نیازی‌ به‌ جدا کردن‌ قطعه‌ مورد نظر از محل‌ استقرارش‌ در DNA نمی‌باشد حالیکه‌ این‌ محدودیت‌ در روشهای‌ کلونینگ‌ وجود دارد.
 

اصول‌ و مبانی PCR 
‌‌‌‌واکنش‌ زنجیره‌ پلی‌مراز مبتنی‌ بر تکثیر آنزیمی‌ قطعه‌ای‌ از DNA است‌ که‌ با استفاده‌ ازآغازگر صورت‌ می‌گیرد. طول‌ آغازگر بایستی‌ به‌ اندازهِ کافی‌ بزرگ‌ باشد تا توالیهای‌ مشابه‌ به‌ آنها درنواحی‌ غیر هدف‌ یافت‌ نگردد پرایمرها دو عمل‌ را انجام‌ می‌دهند.
  1. اندازه‌ قطعات‌ تکثیر شونده‌ را مشخص‌ می‌کنند، محل ‌ ژنی‌ که‌ باید تکثیر شود را مشخص‌ می‌کنند.‌‌‌‌
  2. بعد از اتصال‌ آغازگر به‌ مکملهای‌ خود در توالی‌ هدف، انتهای‌ هیدروکسیل‌ َ۳ آنها رو به‌ سوی ناحیه‌ هدف‌ قرار می‌گیرد.
PCR طی‌ سه‌ دورهِ متوالی‌ واسرشت‌ سازی رشتهِ الگو، اتصال‌ آغازگر و بسط توسط آنزیم‌ پلی‌مراز انجام‌ می‌گیرد.
‌‌‌‌در چرخه‌ اول‌ و دوم‌ فرآوردهِ حاصل‌ از بسط‌ دارای‌ طول‌ مشخصی‌ نیست. در چرخه‌ سوم قطعاتی‌ ساخته‌ می‌شود که‌ طول‌ آنها مشخص‌ است‌ از چرخهِ چهارم‌ تکثیر به‌ صورت‌ نمائی‌ است‌
 
پارامترهای‌ سیکلی‌ 
‌‌‌‌روش PCR  بطوردستی‌ (بوسیله‌ حمام‌ آبی) و هم‌ بطور اتوماتیک‌ و با ترموسایکلر صورت می‌گیرد. ابتدا با حرارت‌ 90-94(در۳۰ ثانیه) دو رشته DNA  از یکدیگر جدا می‌شود و سپس‌ بامختصری‌ برودت c 30-65 بمدت‌ (30ثانیه) پرایمرها به‌ مکملهای‌ خود درروی‌ رشته DNA متصل‌ می‌شوند و به‌ دنبال‌ آن‌ با رساندن‌ دما به‌ 57-70(5-2 دقیقه) شرایط‌ برای‌ گسترش‌ پرایمرهای‌چسبیده‌ بوسیلهِ آنزیم‌ تک‌ پلی‌مراز فراهم‌ می‌شود.زمان‌ شیب‌ حرارتی‌ یا زمانی‌ که‌ درجه‌حرارت‌ از مقداری‌ به‌ مقدار دیگر عوض‌ می‌شود بستگی‌ به‌ نوع‌ دستگاه‌ به‌ کار برده‌ شده‌ دارد برای‌اطمینان‌ از اینکه‌ نمونه‌ها به‌ درجه‌ حرارت‌ مورد نظر رسیده‌اند مدت‌ زمان‌ پرش‌ حرارتی‌ بوسیله اندازه‌گیری‌ ترمومتر نمونه‌ درطی‌ یک‌ آزمایش‌ تکثیر انجام‌ می‌شود . گرمای‌ غیرکافی‌ درطی‌ مرحله‌ واسرشت‌ یکی‌ ازعلتهائی‌ است‌ که‌ باعث‌ شکست‌ در واکنش PCR  می‌گردد
 
استخراج DNA  برای PCR  
‌‌‌‌نقطهِ شروع‌ بسیاری‌ از روشهای‌ بیولوژی‌ مولکولی‌ ضرورت‌ جداسازی DNA با کیفیت‌ عالی است. معمولا کیفیت DNA با عواملی‌ از قبیل‌ عدم‌ آلودگی‌ ناشی‌ از RNA، پروتئین، لیپید و سایر ساختارهائی‌ که‌ برای‌ آنزیمهای‌ برشی‌ و پلی‌ مرازها مزاحمت‌ ایجاد می‌کنند سنجیده‌ می‌شود. به‌علت‌ بزرگ‌ بودن‌ اندازهِ DNA در پستانداران، روشهای‌ استخراج DNA  باید حداقل‌ استرس‌ مکانیکی‌ را در طی‌ استخراج‌ ایجاد نمایند.‌‌‌‌ معمولإ روشهائی‌ که‌ در آنها چندین‌ شوینده‌ همچون SDS  و tritonX100 استفاده‌ می‌شود.
که‌ نقش‌ آنها لیز نمودن‌ سلول‌ و کمک‌ به‌ از بین‌ بردن‌ پروتئین‌ متصل‌ به DNA می‌باشد. پروتئین‌زدائی‌ بیشتر از طریق‌ پروتیئناز K صورت‌ می‌گیرد که‌ این‌ ماده‌ در بافر لیز کننده‌ مورد استفاده‌ قرار می‌گیرد. این‌ آنزیم‌ در حضور SDSدر دمای c 56-65 فعالیت‌ دارد تحت‌ این‌ شرایط‌ پروتئین‌ بهتر واسرشت‌ می‌شود برعکس‌ در همین‌ شرایط‌ آنزیمهای‌ دیگر مثل DNAase دناتوره‌ می‌شود.‌‌‌‌ متعاقب‌ استفاده‌ از پروتیئنازK از ایزوپروپانول‌ برای‌ از بین‌ بردن‌ موِثر پروتئین‌ها استفاده می‌شود و باقیمانده‌ پروتئین‌ و لیپید نیز بطور موِثر از طریق‌ کاربرد فنل‌ و کلروفورم‌ از بین‌ می‌رود آلودگی RNA از طریق‌ تیمار کردن‌ نمونه‌ با RNAase از بین‌ می‌رود.‌‌‌‌در روشهای‌ دیگر بعد از پروتئینازK از نمک‌ اشباع‌ برای‌ رفع‌ آلودگی‌ پروتئین‌ استفاده‌ می‌شود در استخراجDNA  از هپارین‌ برایPCR  بهتر است‌ استفاده‌ نشود چون‌ هپارین‌ از فعالیتTaq  پلی‌مراز جلوگیری‌ می‌کند .‌‌‌‌وجودEDTAحداقلmM 2در بافر استخراج‌ باعث‌ می‌شود که‌ کوانزیمهای‌ آنزیم Aase  DN با EDTA شلات‌ شود و از تجزیه‌ تصادفی DNA جلوگیری‌ نماید.
 
تعداد سیکل PCR :
‌‌‌‌بعضی‌ از راهنمایی‌ها برای‌ تعداد سیکلها در مقابل‌ غلظت‌ الگوی‌ آغازی‌ چنین‌ پیشنهاد شده است.
 
طراحی‌ آغازگر:
‌‌‌‌قواعد مشخصی‌ برای‌ اینکه‌ بتوان‌ با اطمینان‌ یک‌ جفت‌ پرایمر موِثر را انتخاب‌ کرد وجود ندارد. در حال‌ حاضر پرایمر بیش‌ از هر عامل‌ دیگری‌ عامل‌ موفقیت‌ یا شکست‌ در یک‌ واکنش‌تکثیری‌ است. بعضی‌ قواعد راهنمایی‌های‌ مفیدی‌ را در مورد طراحی‌ آغازگر می‌کنند که‌ ذیلا به‌ آنها اشاره‌ شده‌ است.
– طول‌ متوسط‌ هر پرایمر بین‌ 18- 30 جفت‌ باز پرایمر با طول‌ کوچک‌ اتصال‌ غیر اختصاصی‌ را افزایش‌ و پرایمر بزرگتر سرعت‌ هیبریداسیون‌ را کم‌ می‌کند 
مقدارG-C دو پرایمر با هم‌ مشابه‌ بوده‌ و حدود ۵۰-۶۰ درصد باشد.
– آغازگرها را باید از نظر مکمل‌ بودن‌ با هم‌ کنترل‌ شوند.
‌‌‌‌پرایمر دایمر یا آغازگر دوتائی‌ یک‌ تکثیر مصنوعی‌ است‌ که‌ اغلب‌ در محصول PCR  مشاهده می‌شود و عبارتست‌ از یک‌ قطعهِ دو رشته‌ای‌ که‌ طول‌ آن‌ تقریبا به‌ مجموع‌ دو پرایمر نزدیک‌ است‌ و هنگامی‌ مشاهده‌ می‌شود که‌ یک‌ پرایمر توسط‌ آنزیم‌ پلیمراز به‌ روی‌ پرایمر دیگر گسترش‌ یابد مکانیزم‌ واقعی‌ که‌ چگونه‌ پرایمر دایمر تشکیل‌ می‌شود بدرستی‌ مشخص‌ نیست. پرایمرها با انتهای‌ مکمل‌ َ۳ مستعد تشکیل‌ دایمر هستند. ضعف‌ در آنزیم Taq  باعث‌ پلیمریزاسیون‌ مستقیم‌ الگوی‌ غیر هدف‌ شود. در هر حال‌ چنانچه‌ پرایمر دایمر بعنوان‌ مانعی‌ مشاهده‌ شوند می‌توان‌ آن‌ را تاحدودی‌ با غلظت‌ حداقل‌ پرایمر و آنزیم‌ کاهش‌ داد.
– در انتهای‌ َ۳ پرایمر باید حداقل C  یا G قرار گیرد در توالی‌هائی‌ پرایمرهائی‌ که‌ انتهای‌ َ۳ آنها غنی‌ ازG+C می‌باشد احتمال‌ اتصال‌ اشتباهی‌ افزایش‌ می‌یابد 
– باید تا حد امکان‌ از توالیهای‌ پالیندرومیک‌ داخل‌ پرایمرها جلوگیری‌ کرد.
– نسبت‌ چهار نوکلئوتید در آغازگر حتی‌المقدور یکسان‌ باشد.
– آغازگر به‌ توالی‌ تکرار شونده‌ ختم‌ نشود.
– دمای Tm دو آغازگر نزدیک‌ هم‌ باشد .
– حد مجاز دمای‌ اتصال‌ پرایمر طراحی‌ شده‌باید بین‌ 65-55 باشد. دمای‌ تکثیر ایده‌آل‌ 62-72 می‌باشد.
‌‌‌‌درجه‌ حرارتی‌ که‌ پرایمر به DNA  الگو متصل‌ می‌شود به‌ طول‌ آغازگر و مقدار GC آن‌ بستگی دارد برای‌ پرایمرهای‌ حاوی GC 50% و دارای‌ 20 نوکلئوتید، دمای‌ 55 درجه‌ سانتیگراد پیشنهاد می‌شود برای‌ افزایش‌ اختصاصی‌ عمل‌ کردن‌ آغازگر حتی‌ ممکن‌ است‌ دماهای‌ بالاتری‌ هم‌ موردنیاز باشد.
‌‌‌‌برای‌ اینکه‌ هر پرایمر با رشته‌ الگوی‌ خودش‌ هیبرید شود لازم‌ نیست‌ که‌ عینا و کاملا مکمل رشتهِ الگو باشد برای‌ طراحی‌ پرایمر اغلب‌ از برنامه‌های‌ کامپیوتری‌ ویژه‌ استفاده‌ می‌شود فاصله‌ بین‌ پرایمرهایی‌ که‌ با DNAی‌ هدف‌ هیبرید می‌شود بطور معمول‌ کمتر از ۱۵ کیلو باز می‌باشد.‌‌‌‌ در حقیقت‌ یک‌ کاهش‌ اساسی‌ در سنتز موِثر هنگامی‌ که‌ محصول‌ تکثیر متجاوز ا زb 1000می‌شود، مشاهده‌ می‌گردد. به‌ همین‌ دلیل‌ طول‌ قطعه‌ مورد تکثیر درPCRنباید بیش‌ ازKb3 باشد وحدمطلوب‌ کمتر ازKb1می‌باشد ‌‌‌‌تکثیر قطعات‌ بسیار طویل‌ و بالایKb 40 مقدور است‌ اما نیاز به‌ روشهای‌ ویژه‌ای‌ دارد.
 
دمای‌ ذوب‌ آغازگر
‌‌‌‌دمای‌ اتصال‌ باید بقدر کافی‌ پایین‌ باشد تا پرایمر و DNA الگو قادر به‌ اتصال‌ باشند و از سوی دیگر باید به‌ قدر مناسب‌ بالا باشد تا از تشکیل‌ اتصالات‌ غیر اختصاصی‌ جلوگیری‌ کند. دمای‌ اتصال‌ از روی‌ شاخصی‌ به‌ نام‌ درجه‌ حرارت‌ ذوب‌ محاسبه‌ می‌شود. دمای‌ ذوب‌ درجه‌ حرارتی‌ است‌ که‌ درآن‌ نیمی‌ از DNA به‌ صورت‌ تک‌ رشته‌ای‌ درآمده‌ است. یکی‌ از مهمترین‌ مشخصات Tm ‌وابستگی‌ آن‌ به‌ ترکیب‌ بازی DNA  است. G و C سه‌ پیوند هیدروژنی‌ و بازهای‌ آدنین‌ و تیمین‌ دوپیوند هیدروژنی‌ دارند. بنابراین‌ هر چقدر مقدار گوانین‌ و سیتوزین‌ در DNA بیشتر باشد Tmبیشتراست. دمای‌ 2-1 درجه‌ سانتیگراد کمتر از Tm کافیست‌ که‌ هیبریداسیون‌ بین‌ پرایمر و DNAی‌ الگو در آن‌ صورت‌ گیرد. دمای‌ ذوب‌ بطور معمول‌ از طریق‌ فرمول‌ سادهِ زیر نیز محاسبه‌ می‌شود.
 
c 0Tm = ]4 * (G + C) + 2 * (A + T) برای‌ هر پرایمر ۲۰ نوکلئوتیدی‌
 
‌‌‌‌دو پرایمر باید طوری‌ طراحی‌ شوند که‌ دارای Tm  یکسان‌ باشند در غیر اینصورت‌ درحرارت‌ مناسب‌ برای‌ یک‌ پرایمر برای‌ جفت‌ دیگر نامناسب‌ خواهد بود.‌‌‌‌بسیاری‌ از آزمایشگاهها دمای‌ چسبیدن‌ را از ۵-۳ درجه‌ سانتیگراد زیر دمای‌ ذوب (Tm)  که‌ طریق‌ این‌ فرمول‌ محاسبه‌ شده‌است‌ درنظر می‌گیرند. از این‌ موضوع‌ نتیجه‌ گرفته‌ می‌شود که‌ پرایمرهای‌ با طول‌ زیاد باعث‌ افزایش‌ بالا رفتن‌ اختصاصی‌ بودن‌ واکنش‌ نمی‌شود.
بعضی‌ از محققین‌ رابطه‌ زیر را برای‌ محاسبه Tm  پرایمر بکار می‌برند.
 
(FA) 36/0/L) – 005(G + C) – ( 114/0 ]j+[ + 01Log)6/61 + 5/18Tm = 
Kcl غلظت‌ کاتیون‌ منو و لنت j= 
‌‌ طول‌ الیگو نوکلئوتید L= 
‌‌فرمامید که‌ یک‌ افزایندهِPCR است FA =
‌‌‌‌بطور معمول PCR در غیاب‌ فرمامید انجام‌ می‌شود بنابراین‌ می‌توان‌ آن‌ را از آخر فرمول حذف‌ کرد. این‌ فرمول‌ برای‌ پرایمرهای‌ 07-41 بازی‌ مناسب‌ است.‌‌‌‌ فرمول‌ دیگر برای‌ محاسبه Tm پرایمر برای‌ نوکلئوتیدهای bp 20-35 مناسب‌ می‌باشدبصورت‌ زیر است.
(Ln) 64/1 + 22Tp = 
‌‌‌‌که‌ در آن G + C ) + ( A + T ) = Ln  2) طول‌ پرایمر و TP دمای‌ مناسب‌ اتصال‌ است
 
غلظت‌ پرایمرها و روش‌ اندازه‌گیری‌ آن‌ 
‌‌‌‌غلظت‌ پرایمر بین‌ 50/0 تا ۵/۰ میکرومول‌ و حد مطلوب‌ 6/0 – 1/0 برای‌ یک‌ واکنش ۲۵ میکرولیتری‌ می‌باشد. غلظت‌ بالای‌ پرایمر باعث‌ بسط‌ غیر اختصاصی‌ و پرایمر-دایمر می‌شود. بعضی‌ از منابع‌ روش‌ زیر را برای‌ محاسبه‌ غلظت‌ پرایمر پیشنهاد کرده‌اند‌‌‌‌برای‌ انجام‌ این‌ محاسبه‌ ابتدا لازمست‌ که‌ ضریب‌ تکثیر مولی‌ پرایمر در ۲۶۰ نانومتر محاسبه شود که‌ غلظت‌ مولی‌ می‌تواند با استفاده‌ از فرمول‌ زیر محاسبه‌ شود. روش‌ دیگر محاسبه‌ براساس OD 4 می‌باشد.
 
اتصال‌ پرایمر
‌‌‌‌دما و مدت‌ زمان‌ لازم‌ برای‌ اتصال‌ پرایمر به: ۱) طول‌ پرایمر، ۲) ترکیب‌ نوکلئوتید۳) غلظت‌ پرایمر بستگی‌ دارد.‌‌‌‌با توجه‌ به‌ طیف‌ فعالیت‌ آنزیم Taq  پلی‌مراز که‌ در محدوده‌ 58-02 درجه‌ سانتیگراد می‌باشد دمای‌ اتصال‌ در محدودهِ ۷۲-۵۵ درجه‌ سانتیگراد بطور معمول‌ بهترین‌ نتیجه‌ را می‌دهد افزایش‌دمای‌ اتصال‌ بسط‌ غیراختصاصی‌ را در انتهای‌ َ۳ پرایمر کاهش‌ می‌دهد. دمای‌ پایین‌ تکثیر همراه‌ باغلظت‌ اختصاصی‌ بودن‌ واکنش‌ را کاهش‌ می‌دهد
 
بسط‌ پرایمر
‌‌‌‌مدت‌ زمان‌ بسط‌ بستگی‌ به‌ عوامل: ۱) طول‌ توالی‌ هدف، ۲) غلظت‌ توالی‌ هدف‌ و ۳) دمای تکثیر دارد.‌‌‌‌بسط‌ پرایمر بطورمعمول‌ دردمای‌ 72 درجه‌ سانتیگراد انجام‌ می‌شود یک‌ زمان‌ بسط‌ دقیقه‌ای‌ در ۷۲ درجه‌ سانتیگراد برای‌ فرآورده‌های‌ معادل‌ 2 کیلو باز کافیست‌
 
بافر PCR 
‌‌‌‌متداولترین‌ بافر PCR که‌ همراه‌ با تک‌ پلی‌ مراز استفاده‌ می‌شود حاوی‌ غلظت‌ 10 برابرکه‌ قبل‌ از استفاده‌ باید به‌ نسبت‌ (10:1) رقیق‌ شود این‌ بافر حاوی‌ اجزای‌ زیر است.
‌‌‌‌برای‌ یک‌ واکنش PCR ‌، غلظت Tris – Cl ‌،mM 05-01 می‌باشد KCl با غلظت‌ در حد mM05 را می‌توان‌ در مخلوط‌ واکنش‌ بمنظور آسان‌ شدن‌ اتصال‌ پرایمر به‌ رشته‌ الگو اضافه‌ کرد NaCl با غلظت mM 05 یاKCl با غلظت‌ بیش‌ از mM 50 اثر باز دارندگی‌ بر روی‌ فعالیت‌ آنزیم‌ تک‌ پلی‌ مراز دارند.
 
غلظت‌ منیزیم‌
‌‌‌‌غلظت‌ منیزیم‌ در تکثیر اختصاصی‌ و نیز فعالیت‌ آنزیم Taq پلی‌ مراز موِثر است PCR . بایستی‌ دارای‌ 5/0 تا ۵/۲ میلی‌ مول‌ منیزیم‌ باشد حضور EDTA در مقدار منیزیم‌ اشکال‌ ایجاد می‌کند غلظت MgCl2 در مخلوط‌ نهائی‌ واکنش‌ می‌تواند متغیر باشد معمولا میزان‌ بهینه‌ آن‌ درمحدودهِ ۵-۵/۰ میلی‌ مول‌ است.‌‌‌‌
یون‌ +2Mg دو عمل‌ انجام‌ می‌دهد:
اول‌ اینکه‌ با dNTP یک‌ ترکیب‌ قابل‌ حل‌ ایجاد می‌کنند،
دوم‌ فعالیت Taq پلی‌ مراز را تحریک‌ می‌کند ‌‌‌‌معمولا کمبود +۲Mg باعث‌ کاهش‌ بازده‌ و زیادی‌ آن‌ باعث‌ تکثیر غیراختصاصی‌ می‌شود. 
آنجائی‌ که dNTP  می‌تواند به‌ +2Mg بچسبد، تعیین‌ دقیق‌ غلظت‌ منیزیم‌ به‌ غلظت dNTP بستگی‌دارد در غلظت‌ مناسب‌ منیزیم‌ و افزایشmM 6-4dNTP ،سرعت‌ سنتز تک‌ پلی‌ مراز ۳۰-۲۰ درصد کاهش‌ می‌یابد.
 
دی‌اکسی‌ نوکلئوزیدتری‌ فسفاتها (dNTP)
dNTP به‌ دو صورت‌ منفرد یا مخلوطی‌ از چهار dNTP تهیه‌ می‌شود. pH اکثر محلولهایاستوک‌ با NaOH به‌ 5/7 رسانده‌ می‌شود. PCR معمولا با غلظت‌ حدود میلی‌مولdNTP 100 انجام‌ می‌گیرد اما غلظت‌ مناسب dNTP بستگی‌ به‌ غلظت MgCl2، غلظت‌ پرایمر، طول‌ محصول‌ تکثیر شده‌ و تعداد سیکلهای PCR دارند. محلولهای‌ پایه dNTP در ۲۰- درجه‌ سانتیگراد نگهداری‌ می‌شود. و این‌ محلولهای‌ پایه‌ dNTP باید تا PH=7 خنثی‌ شود و از طریق‌ اسپکتوفتومتر تعیین‌ غلظت‌ شوند.‌‌‌‌ در کارهای‌ مولکولی‌ توصیه‌ می‌شود که‌ در محلول‌ کار، از هر dNTP یک‌ میلی‌ مول‌ موجود باشد ‌‌‌‌برای‌ به‌ حداقل‌ رساندن‌ خطاها هرنوع dNTP باید درغلظت‌های‌ مساوی‌ بکاربرده‌ شوند یعنی از علل‌ بسط‌ غیراختصاصی‌ غلظت‌ کمتر از یک‌ میکرومول dNTP  یا غلظت‌ کم‌ یکی‌ از بازها است‌‌‌‌ ترکیب‌ دمای‌ بالا بسط‌ و اتصال‌ بالای‌ 55 درجه‌ و غلظت‌ پایین‌ 50-10 میکرومول dNTP ‌باشد. باعث‌ بیشترین‌ دقت‌ در فرآوردهِ نهایی PCR می‌شود
 
آنزیمهای‌ پلی‌مراز
DNA پلی‌ مرازها آنزیمهائی‌ هستند که‌ با استفاده‌ از منومرهای‌ دی‌اکسی‌ نوکلئوزیدتری فسفات‌ و با الگو قرار دادن‌ رشته‌ اصلی‌ ساخت‌ زنجیره‌ پلی‌ نوکلئوتیدی‌ را تسریع‌ می‌کنند. ساخت‌ DNA معمولا از جهت‌ َ۵ بطرف‌ َ۳ است، زیرا پلی‌مریزاسیون‌ اغلب‌ از ۵ آلفا فسفات‌ دزکسی‌نوکلئوتید تری‌فسفات‌ بطرف‌ پایانهِ ۳ گروه‌ هیدروکسیل‌ رشته DNA  است. DNA پلی‌ مراز برخلاف‌ RNA پلی‌مراز نیاز به‌ قطعهDNA  کوچک‌ یا پرایمر برای‌ چسبیدن‌ به‌ توالی‌ مکمل‌ دارد DNA پلی‌ مرازها قادر به‌ تکثیر قطعاتی‌ با حداکثر ۴۰۰ جفت‌ باز می‌باشند و در دماهای‌ بالا علت‌ حساس‌ بودن‌ این‌ آنزیم‌ نسبت‌ به‌ دما باید مرتبا پلیمراز جدیدی‌ اضافه‌ شود. این‌ نحوه‌ عمل‌ سرعت‌ و دقت‌ عمل‌ را پایین‌ می‌آورد.
 
DNA پلی‌مراز تگ‌ 
‌‌‌‌حسن‌ این‌ نوع DNA  پلی‌ مراز درجه‌ حرارت‌ بالا (۵۹-۰۹ درجه‌ سانتیگراد) آن‌ است. علاوه بر این‌ آنزیم‌ تک‌ می‌تواند قطعات DNA به‌ طول‌ 10 هزار جفت‌ را تکثیر کند.‌‌‌‌ استفاده‌ از DNA پلیمراز مقاوم‌ به‌ حرارت‌ حاصل‌ از باکتری‌ ترموس‌ آکواتیکوس‌ که‌ منشاء چشمه‌ آب‌ گرم‌ پارک‌ ملی‌ یلواستون می‌باشد باعث‌ ساده‌ و خودکار شدن‌ واکنش‌ می‌شود. پلی‌مرازهای‌ مقاوم‌ در برابر حرارت‌ موجب‌ شده‌اند که‌ بسط‌ اختصاصی‌ فرآورده PCR  بخاطر اتصال‌ وبسط‌ آغازگر در دمای‌ بالا افزایش‌ یابد.‌‌‌‌ دمای‌ مناسب‌ برای‌ فعالیت‌ این‌ آنزیم‌ با توجه‌ به‌ الگوی DNA ‌، برابر ۸۰-۷۵ درجه‌ سانتیگراد است. در دمای‌ 70 درجه‌ سانتیگراد بیش‌ از ۶۵ نوکلئوتید در ثانیه‌ پلی‌ مریزه‌ می‌شود.
 
غلظت‌ آنزیم‌
‌‌‌‌غلظت‌ توصیه‌ شده‌ برای‌ تگ‌ پلی‌مراز بین‌ 5/2-1 واحد در صد میکرو لیتر واکنش‌ توصیه شده‌ است. در صورتیکه‌ غلظت‌ آنزیم‌ بسیار بالا باشد، فرآورده‌های‌ زمینه‌ای‌ غیراختصاصی‌ افزایش‌می‌یابد و پایین‌ بودن‌ بیش‌ از حد غلظت‌ نیز باعث‌ کم‌ شدن‌ فرآورده‌های‌ مورد نظر می‌شود. برای‌تکثیر DNAژنومی‌ یک‌ غلظت‌ بهینه‌ از Taq معمولا حدود ۴-۱ واحد درصد میکرو لیتر واکنش‌توصیه‌ می‌شود.
 
اختصاصی‌ بودن‌ واکنش‌ 
‌‌‌‌آنزیم‌ مناسب‌ و کنترل‌ عواملی‌ از جمله‌ غلظت‌ آنزیم، غلظت‌ قطعات‌ آغازگر، همانندسازی‌درجه‌ حرارت‌ دقیق‌ و زمان‌ نگهداری‌ محیط‌ عمل‌ در یک‌ درجه‌ حرارت‌ معین‌ و تعداد چرخه‌ در هرآزمایش‌ همه‌ در اختصاصی‌ بودن‌ واکنش‌ اثر می‌گذارند.‌‌‌‌ بطور کلی‌ عواملی‌ که‌ در کارآیی PCR  ایفای‌ نقش‌ می‌کنند عبارتند از:
غلظتMgCl2 ‌، کیفیت‌ و کمیت DNA الگو، بافر PCR، غلظت dNTP، افزاینده‌های PCR،بازدارنده‌های PCR ‌،Nested PCR ،PCR با شروع‌ داغ، تعداد سیکل PCR  و دمای‌ اتصال‌ پرایمر
 
مهار کننده‌ها و افزایش‌ دهنده‌های PCR 
‌‌‌‌مواد لیست‌ شده‌ در جدول‌ ذیل‌ می‌توانند درPCR حاوی‌ نقش‌ باشند.‌‌‌‌ ژلاتین‌ یا آلبومین‌ سرم‌‌100 نانوگرم‌ در ۵۰ میکروگرم‌ واکنش‌‌‌ فرمامید‌‌ 5%، ‌‌دی‌متیل‌ سولفوکساید‌‌( DMSO) 01-2% پیروفسفاتاز‌‌ واکنش‌واحد ۱۰۰/۰ – 01،‌‌تترامتیل‌ آمونیوم‌ کلراید‌‌( TMAC) 001-01 میکرومول‌ ‌‌پلی‌اتیلن‌ گلایکول‌ 0006‌‌51-5 درصد،‌‌گلیسرول‌‌ 5-1 درصد،‌‌توین‌ 02‌‌5/2-1 درصد،‌‌پروتئین‌ ژن‌ 23‌‌2 نانومول‌،‌‌7 دی‌اَز – َ۲‌dGTP-با ۵۷% جایگزین‌،‌‌پروتئین‌ تک‌ رشته‌DNA 1واحد،‌‌کلی‌باسیل‌ ‌‌1 واحد، ‌‌بتائین‌‌5 میکروگرم‌ در میلی‌لیتر، ‌‌‌‌ژلاتین‌ یا آلبومن‌ سرم‌ حیوانی‌ به‌ غلظت‌ 100 میکروگرم‌ بر میلی‌ لیتر و شوینده‌ غیریونی‌ مانندتوین‌ 02 یا Laurth-21 (1/0 تا ۵۰/۰) درصد برای‌ ثبوت‌ پایداری‌ آنزیم‌ اضافه‌ می‌شود.DMSO ساختمان‌ ثانویهDNA  هدف‌ را کاهش‌ می‌دهد. آزمایشات‌ نشان‌ داد. بطور سطحی‌ اثر بازدارندگی‌ بر رویTaq  داشته‌ و باعث‌ کاهش‌ بازده‌ کل‌ شده‌ است. شوینده‌های‌غیریونی‌ نظیرTritonX100 و توین‌20 تا غلظت‌ 5% مهار کننده‌ نیست‌ شوینده‌های‌ یونی‌ مانندسدیم‌ دودسیل‌ سولفات(SDS)  فقط‌ در غلظت‌های‌ بسیار پایین‌ قابل‌ تحمل‌ است‌ و این‌ شوینده‌ باروش‌ استخراج‌ فنل‌ و رسوب‌ اتانل‌ قبل‌ ازPCR ازDNA حذف‌ می‌شود.SDS در غلظت‌ 2-1 درصد استفاده‌ می‌شود در حالیکهTaq  پلی‌مراز در غلظتهای‌ بالاتر. ۱ر۰درصدSDS مهار می‌شود.Taq پلی‌مراز به‌ عمل‌ هضمی‌ پروتیئنازK حساس‌ است، بنابراین‌ پروتیئنازK بایستی‌ حذف یا غیرفعال‌ شود. دمای‌ 59 درجه‌ سانتیگراد برای‌ رسیدن‌ به‌ چنین‌ هدفی‌ کفایت‌ می‌کند. تیمار کردن‌حرارتی‌ و سپس‌ استخراج‌ بوسیلهِ فنل‌ پروتیئنازK را واسرشت‌ می‌کند. آثار باقیماندهِ فنل‌ می‌تواندباعث‌ مهارPCR شود که‌ توسط‌ کلروفورم‌ حذف‌ می‌شود.
 
شروع‌ داغ‌ 
‌‌‌‌چنانچه‌ لازم‌ باشد تعداد زیادی‌ نمونهِPCR آماده‌ گردد. ایجاد شرایط‌ یکنواخت‌ و مساوی برای‌ هر تیوپ‌ مشکل‌ است‌ علاوه‌ بر این‌ باز و بسته‌ کردن‌ تیوپ‌ برای‌ انجام‌ نمونه‌ برداری‌های‌مختلف‌ باعث‌ می‌شود که‌ خطر آلودگی‌ بالا رود. بنابراین‌ اجزای‌ واکنش‌ را بطور فیزیکی‌ با ماده‌ای‌ که‌بعنوان‌ مانع‌ بکار برده‌ می‌شود می‌توان‌ جدا کرد. هنگامیکه‌ این‌ ماده‌ در حین‌ بالا رفتن‌ دما ذوب‌می‌شود آن‌ ماده‌ عاملی‌ برای‌ مخلوط‌ شدن‌ تمام‌ اجزای‌ واکنش‌ بطور همزمان‌ در زمان‌ شروع PCR ‌می‌باشد 
‌‌‌‌به‌ عنوان‌ مثال‌ در این‌ تکنیک‌ اجزای‌ ترکیب‌ شونده PCR  به‌ جز DNAپلی‌مراز و الگوی DNA با همدیگر مخلوط‌ می‌شوند. سپس‌ یک‌ عدد آمپلی‌ واکس‌ به‌ مخلوط‌ اضافه‌ می‌شود که‌ در ۸۰-۷۵ درجه‌ به‌ مدت‌ 10-5 دقیقه‌ ذوب‌ می‌شوند سپس‌ اجازه‌ داده‌ می‌شود که‌ قطعه‌ مومی‌ خنک‌و به‌ حالت‌ جامد درآید و اجزای‌ باقیمانده‌ واکنش‌ که‌ شاملDNA  پلی‌مراز و الگویDNA  و بافرمی‌باشد بر روی‌ قطعه‌ مومی‌ اضافه‌ و تیوپها در ترموسایکلر قرار داده‌ می‌شوند. اگر ما موم‌ را ذوب‌کنیم، اجزای PCR  به‌ همدیگر مخلوط‌ می‌شود و موم‌ به‌ سمت‌ بالا و در سطح‌ مایع‌ قرار می‌گیرد.پس‌ از اتمامPCR  تیوپها در دمای‌ زیر ۳۵ درجه‌ خنک‌ می‌شوند و موم‌ به‌ حالت‌ جامد در می‌آید.
PCR آشیانه‌ای‌ 
PCR آشیانه‌ای‌ یکی‌ از راههای‌ افزایش‌ دقت PCR  می‌باشد. در این‌ روش‌ از دو نوع‌ پرایمر استفاده‌ می‌شود. ابتدا پرایمر اول‌ اضافه‌ می‌شود و باعث‌ تکثیر قطعاتی‌ از DNA می‌شود که‌ احتمال‌دارد به‌ میزان‌ دلخواه‌ اختصاصی‌ نباشد سپس‌ پرایمر دوم‌ اضافه‌ می‌شود که‌ خصوصیات‌ آن‌ تکثیر قسمت‌ داخلی‌تر یا بعبارت‌ دیگر اختصاصی‌تر می‌باشد.‌‌‌‌در واقع‌ جفت‌ پرایمر دوم‌ پرایمرهائی‌ هستند که‌ داخل‌ جفت‌ اولیه‌ هستند و قطعات‌ طویلتر بوسیله‌ اولین‌ دور PCR تولید می‌شوند به‌ عنوان‌ یک‌ الگو برای PCR دوم‌ بکار می‌روند.
اثر فلات‌
‌‌‌‌کاهش‌ سودمندی‌ تکثیر و رسیدن‌ به‌ یک‌ سطح‌ ثابت‌ تکثیر در نتیجه‌ کاهش‌ مقدار آنزیم‌ سیکل‌های‌ بعدی‌ را در اصط‌لاح‌ اثر فلات‌ در واکنش‌ تکثیری‌ گویند. این‌ فلات‌ در PCR با Taq خیلی‌دیرتر از واکنش‌ که‌ با آنزیم‌ کلنو انجام‌ می‌شود تشکیل‌ می‌شود و بطورکلی‌ اختصاصی‌ بودن‌ واکنش‌ راافزایش‌ می‌دهد.
آلودگیهایPCR 
‌‌‌‌در عمل PCR  باید از تکثیر آلوده‌کننده‌هایی‌ مانند DNA های‌ تکثیر شده‌ در آزمایشهای‌ قبل جلوگیری‌ به‌ عمل‌ آید. منابع‌ زیادی‌ برای‌ آلودگی PCR  وجود دارد که‌ در جدول‌ زیر آمده‌ است
‌‌منابع‌ بالقوه‌ آلودگی PCR 
هود و تهیه‌ فیلترها‌‌، دستگاه‌ الکتروفوژ، لوله‌های‌ سانتریفوژ، وارد کردن‌ نوک‌ پپیت‌ به‌ ژل، ترموسایکلر، بلوک‌های‌ حرارتی، روشهای‌ جمع‌آوری‌ نمونه، آب‌ یا سیستم‌ خنک‌ کننده،‌ محیط‌ آزمایشگاه، پرسنل‌ آزمایشگاه، دستگاه‌ هموژنیزه‌ کننده‌ بافت‌
‌‌منابع‌ بالقوه‌ آلودگی‌ 
‌‌‌‌برای‌ جلوگیری‌ از آلودگی PCR  آزمایشات‌ باید در هود ویژه‌ یا حداقل‌ قسمتی‌ از آزمایشگاه‌ صرفا به‌ اینکار اختصاص‌ داده‌ شده‌ قرار گیرد. تجهیزات‌ و محلولهائی‌ که‌ مرتب‌ در PCR کاربرد دارد باید تحت‌ نگهداری‌ ویژه‌ باشد‌‌‌‌ هر ماده‌ که‌ قابل‌ اتوکلاو کردن‌ است‌ باید استریل‌ شود و از دستکش‌ در تمام‌ مراحل‌ PCR ‌استفاده‌ کرد و همچنین‌ عینک‌ و روپوش‌ آزمایشگاهی‌ نیز لازم‌ است. محلولهائی‌ مانند بافر و dNTP باید در سیستمهای‌ بسته‌ نگهداری‌ شود و برای‌ جلوگیری‌ از آلودگی‌ محلول‌ پایه‌ را باید به‌ چندقسمت‌ تقسیم‌ نمود. در ذیل‌ بعضی‌ از روشها که‌ مانع‌ آلودگی‌ می‌شود ذکر شده‌ است‌ 
– اوراسیل‌ – ان‌ – گلیلوسیلاز (این‌ آنزیم‌ محصولات‌ قبلیPCR  را از بین‌ می‌برد
– اشعه‌ ماوراء بنفش‌ 
– تیمار آنزیمی‌ 
– مدت‌ زمان‌ واسرشت‌ شدن‌ 
– درجه‌ حرارت‌ واسرشت‌ شدن‌ 
– تعداد چرخه‌ 
– استفاده‌ ازdUTP به‌ جایdTTP ‌،
روغنهای‌ معدنی‌ 
‌‌‌‌روغنهای‌ معدنی‌ سبک‌ برای‌ پوشاندن‌ مخلوط PCR  و جلوگیری‌ از تبخیر به‌ کار می‌روند بطورکلی‌ حدود ۶۰-۴۰ میکرولیتر از روغن‌ به‌ 100 میکرولیتر از محلول PCR  اضافه‌ می‌شود روغن‌ همچنین‌ از آلودگی‌ نمونه‌ها جلوگیری‌ می‌کند چنانکه‌ سرپوش‌ ترموسایکلر گرم‌ شود احتیاجی‌ به‌پوشش‌ با روغن‌ نمی‌باشد روغن‌ را با پیپت‌ یا استخراج‌ با کلروفورم‌ براحتی‌ می‌توان‌ خارج‌ ساخت‌
 
بحث تکمیلی
 
 
که برخی از آنها عبارتند از: کلونینگ DNA برای تعیین توالی (Sequencing)، فیلوژنی بر پایه DNA، بررسی های عملکردی ژنها، تشخیص های ارثی ، شناسایی و انگشت نگاری ژنتیکی و ردیابی و تشخیص بیماریهای عفونی. در سال ۱۹۹۳ مولیس بخاطر ابداع این روش، جایزه نوبل را دریافت نمود.
 
بطور کلی مراحل PCR به صورت زیر است:
 
۱-  مرحله آغاز (Initialization step): این مرحله شامل گرم کردن مواد به درمای حدود ۹۶-۹۴ (یا ۹۸ درجه زمانی که از پلیمراز فوق العاده مقاوم به حرارت استفاده می شود) است که معمولا ۹-۱ دقیقه بطول می انجامد. البته این مرحله در مواردی بکار می رود که پلیمراز مورد استفاده جهت انجام فعالیت نیازبه گرم شدن دارد که به Hot- start PCR معروف است.
 
۲-  مرحله دناتوراسیون( Denaturation Step): این مرحله اولین مرحله معمول PCR  بوده و شامل گرم کردن محیط به میزان ۹۸-۹۴ درجه به مدت ۳۰-۲۰ ثانیه است. این عمل باعث ذوب شدن DNA (جدا شدن دو رشته DNA از همدیگر) هم DNA الگو و هم DNA پرایمر از طریق از بین رفتن باندهای هیدروژنی بین نوکلئوتیدهای دورشته DNA و تولید DNA تک رشته ای است.
 
۳-  مرحله اتصال (Annealing step): در این مرحله درمای واکنش به ۶۵-۵۰ درجه به مدت ۴۰-۲۰ ثانیه کاهش می یابد تا امکان اتصال DNA پلیمراز و پرایمر به DNAالگو که حالا تک رشته ای است فراهم آورد. بطور تیپیک درجه حرارت اتصل حدود ۵-۳ درجه کمتر درجه حرارت ذوب شدن پرایمر انتخاب می شود. مناسب ترین اتصال DNA-DNA بین رشته الگو و پرایمر زمانی ایجاد می گردد که هر دورشته در فاصله نزدیکی از هم قرار گیرند و هرچه توالی پرایمر با توالی رشته الگوی متناسب تر باشد این اتصال قوی تر بوده و اتصال قوی جهت انجام عمل پلیمراز مورد نیاز است. (نرم افزار  blast برای طراحی پرایمر استفاده می شود).
 
۴-   مرحله گسترش یا طویل شدن (Extension/Elongation step): درجه حرارت این مرحله به آنزیم پلیمراز مورد استفاده و درجه حرارت اپتیمم مورد نیاز برای آن بستگی دارد. بطور مثال آنزیم Taqپلیمراز در درجه حرارت ۸۰-۷۵ درجه سانتیگراد فعالیت قابل قبول داشته  ولی بطور معمول از درجه حرارت ۷۲ درجه سانتیگراد برای این آنزیم استفاده می شود. در این مرحله پلیمراز نوکلئوتیدهای مکمل را بر اساس رشته الگو از ۵’-3’ در کنار هم قرار داده و در نهایت رشته مکمل رشته الگوی اولیه را تولید می کند.  مدت زمان این مرحله به پلیمراز و طول رشته DNA الگو بستگی دارد. به عنوان یک قانون در درجه حرارت اپتیمم پلیمراز بایستی ۱۰۰۰ نوکلئوتید در دقیقه را پلیمریزه نماید. در شرایط مساعد برای مثال اگر محدودیت سوبسترا وجود نداشته باشد در هر مرحله گسترش DNA دوبرابر می شود.
 
۵-  طویل شدن نهایی( Final Elongation): این مرحله فقط یکبار و پس از آخرین سیکل PCR و در دمای ۷۴-۷۰ درجه بمدت ۱۵-۵ دقیقه صورت میگیرد جهت اطمینان از تبدیل کلیه DNAهای تک رشته ای به دورشته ای انجام می گیرد.
 
۶-   مرحله نهایی (Final Hold): این مرحله در ۱۵-۴ درجه سانتیگراد جهت نگه داری کوتاه مدت محصولات واکنش تا زمان استخراج انجام می گیرد.
 
 جهت اطمینان از اینکه محصول PCR همان توالی مد نظر بوده از الکتروفورز برروی ژل استفاده می شود. در این روش جهت مشخص کردن قطعه DNA با وزن مولکولی مشخص و مورد نظر از DNA Ladder استفاده می شود و قطعه مورد نظر در الکتروفورز از روی اندازه مولکولی استاندارد و کنترل مثبت مشخص می گردد. در روش Real-Time PCR  نیاز به الکتروفروز بعد PCR نیست.
 
 
 
انواع تکنیکهای PCR:
 
این تکنیکها از طریق ایجاد تغییرات مختصری در تکنیک PCR اولیه برای مثال ایجاد تغییرات در نحوه بکارگیری پرایمرها و… ایجاد و ابداع شده و جهت اهداف خاصی برنامه ریزی و اختصاصی شده اند .
 
۱-      Allele-specific PCR
 
۲-      Assembly PCR یا PCA (Polymerase Cycling) Assembly
 
۳-      PCR نامتقارن (Asymetric PCR)
 
۴-      Helicase – Dependent amplification 
 
۵-      Hot-start PCR
 
۶-      Inter sequence  specific PCR ISSR 
 
۷-      Inverse PCR
 
۸-      Ligation-mediated PCR
 
۹-      (Methylation – specific PCR (MSP
 
۱۰-    MiniPrimer PCR
 
۱۱-     Multiplex PCR   
 
۱۲-    Multiplex Ligation- dependent Probe Amplification MLPA
 
۱۳-    Nasted PCR
 
۱۴-    Overlap Extension PCR
 
۱۵-    ( Quantitative PCR (Q-PCR
 
۱۶-    Reverse Transcription PCR
 
۱۷-    Solid Phase PCR 
 
۱۸-    ( Thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL PCR
 
۱۹-    PAN-AC
 
۲۰-    Touch Down PCR
 
۲۱-    Universal Fast Walking
 
۲۲-    RFLP-PCR(PBR) 
 
۲۳-    SSCP-PCR               
 
۲۴-    SOEING 
 
۲۵-  RAPD-PCR یاArbitraily  primed – PCR
 
۲۶-   ARMS- PCR
 
۲۷-    Real-Time-PCR                    
 
۲۸-    BOOSTER-PCR            
 
۲۹-    DAF-PCR  
 
۳۰-    SCAR-PCR          
 
۳۱-     AFLP    
 
۳۲ -ALP,ST          
 
  
 
‏Multiplex – PCR: یکی از روش‌های تغییریافته ‏PCR‏ است که در آن تنها یک جایگاه ژنی مورد بررسی قرار می‌گیرد، با استفاده از پرایمرهای مختلف می‌توان چندین جایگاه را مورد بررسی قرار داد و از چندین جفت پرایمر اختصاصی جهت تکثیر استفاده می‌شود. کاربردهای این روش می‌تواند شامل موارد زیر باشد: ‏
 
۱-  بخش‌های بزرگی از یک ‏DNA‏ (هدف، جهت جست‌وجوی تغییرات می‌تواند بررسی شود. برای مثال کشف نقص‌ها در بیماری دیستروفی عضلانی روشن یا کشف بخش‌های مختلف ‏IS6110‎‏ و ‏IS986‎‏ در مایکروباکتریوم توبر کلوزیس عامل بیماری سل، ‏
 
‏2-  بخش‌های غیرمربوط به هم در ژنوم هدف می‌تواند مورد آزمایش واقع شود.‏
 
‏3-  می‌توان از طریق این روش با پرایمرهای مختلف به جست‌وجوی عوامل مختلف پرداخت، مانند شناسایی عوامل شایع مننژیت. این روش بیشتر برای شناسایی جایگاه‌هایی از ژن‌ها به کار می‌رود که انواع زیادی از جهش در آنها به وقوع می‌پیوندد.‏
 
 
 
 ‏RT- PCR‏)‏: این روش به ‏PCR‏ نسخه‌برداری معکوس نیز معروف است که ماده اولیه در آن ‏RNA‏ است. اولین مرحله در این روش تبدیل ‏RNA‏ به ‏DNA‏ (‏ DNAای که مکمل توایس‌های ‏mRNA‏ است) توسط آنزیم نسخه‌بردار معکوس می باشد (RT). برخی از موجودات مانند برخی از ویروس‌های ‏RNAدار، ژنومشان تنها از ‏RNA‏ ساخته شده است. بعضی از ویروس‌ها مانند ویروس هپاتیت ‏B‏ هرگز به شکل ‏DNA‏ مابین در اثر آنزیم نسخه‌بردار معکوس درنمی‌آید. آنزیم نسخه‌بردار معکوس (‏RT‏) در این روش از  "‏Avian Myeloblastosis Virus (AMV)‎‏" و "‏Moloney Murine Leu Kemia Virus (MMLV)‎‏ " به‌دست آمد.
 
کاربرد این آنزیم به‌دلیل آن‌که آنزیم به حرارت حساس بود در ابتدا پایین بود ولی با کشف باکتری به نام "ترموس ترموفیلوس" یک ‏DNA‏ پلیمر از مقاوم به نام )‏Tth‏( بهبود یافت که در حضور یون ‏Mn+2‎‏ دارای فعالیت نسخه‌برداری معکوس است و در دمای ۷۲ درجه سانتیگراد توسط این آنزیم از روی ‏RNA، ‏DNA‏ ساخته می‌شود و سپس ‏Mn+2‎‏ اضافی توسط اتیلن گلیکول تترااستیک اسدی )‏EGTA‏) حذف می‌شود و سپس این آنزیم از ‏DNAای که خود ساخته استفاده و آن را تکثیر می‌کند.‏
 
 
 
 ‏ARMS – PCR‏: این روش تکثیری قدرتمند برای مشخص کردن جهش‌های نقطه‌ای است. در این روش از پرایمرهای جهش یافته و طبیعی در دو لوله جداگانه استفاده می‌شود. اگر عمل پلیمریزاسیون در لوله حاوی پرایمر طبیعی انجام شود، نشان‌دهنده نبود جهش نقطه‌ای در باز مورد نظر است و اگر عمل پلیمریزاسیون در لوله‌ حاوی پرایمر جهش یافته انجام شود، نشان‌دهنده حضور جهش نقطه‌ای در باز مورد نظر است. این روش نام‌های دیگری نیز دارد از جمله ‏MAMA-PCR‏ مخفف ‏Amplificatin Multation Assay‏ ‏Mismatch‏ و ‏COP-PCR‏ مخفف ‏Competitive Oligonucleotide Primming‏. ‏
 
 
 
 ‏Nested – PCR‏: در این روش از دو جفت پرایمر استفاده می‌شود، طوری که جفت دوم در بین جفت اول جای می‌گیرد. در این روش ابتدا پرایمر بیرونی توالی هدف در طول ۳۰-۱۵ چرخه تکثیر می‌شود، سپس محصول ‏PCR‏ حاصل به لوله‌ای دیگر منتقل می‌شود و به‌عنوان الگو و با استفاده از جفت پرایمر داخلی مرحله دوم ‏PCR‏ انجام شده و ترادف کوچکتری از ‏DNA‏ که درون ‏PCR‏ اولی است، به اندازه ۴۰-۱۵ چرخه تکثیر می‌شود.‏
 
مزایای این روش تغییر یافته ‏PCR‏ عبارت است از: ۱- نیاز به پروب (کاوشگر) و تأییدهای بعدی کمتر است، ۲- حساسیت در این روش به میزان زیادی بالاتر است ۳- به دلیل انتقال محصول ‏PCR‏ دور اول به لوله جدید، ممانعت کننده‌ها رقیق می‌شود. این روش در تعیین جنسیت جنین در سه ماهه اول بارداری استفاده شده و از این طریق توانسته‌اند بیماری‌های وابسته به جنس را تعیین کرده و از تولد کودکان بیمار جلوگیری کنند.‏
 
همچنین ویروس "سیتومگالوویدوس" که می‌تواند سبب ناشنوایی در ۱% از کودکان شود، توسط این روش تشخیص داده شده و امکان درمان زودهنگام از این طریق امکان‌پذیر است. جنین‌های مبتلا به سندروم داون نیز در مرحله بارداری مادر با این روش تشخیص داده شدند.
 
 
 
Real Time PCR‏: به علت ورود نسل جدیدی از ترموسایکلرها با سیستم فلورومتری که اجازه پایش پیوسته خاصیت فلوئورسانس محصول ‏PCR‏ در زمان جمع شدن را می‌دهد، این روش ابداع شد. در این روش از کاوشگرها یا پروب‌های هیبریداسیون نشان‌دار شده با رنگ‌های فلورسانس در انتهای ۵ یا ۳ استفاده می‌شود. که امکان پایش پیوسته محصول ‏PCR‏ را بدون جداسازی آنها در روش‌های الکتروفورز در ژل آگاروز یا ژل پلی آکریل آمید می‌دهد. این سیستم در سال ۱۹۹۲ کشف شد. این روش به دلیل کاهش زمان سیلک‌های ‏PCR، حذف مرحله ‏Post-PCR‏ و کاربرد نشانگرهای فلوروژنیک و روش‌های حساس آشکارسازی تابش آنها باعث افزایش سرعت این سیستم نسبت به سیستم ‏PCR‏ معمولی شده است. سازندگان و کاربران این روش سعی می‌کنند محصول ‏PCR‏ کوچک‌تر طراحی کنند تا سرعت افزایش یابد اما تجربه نشان داده که کاهش اندازه محصول لزوماً بازده ‏PCR‏ را بهینه نمی‌کند. البته این روش دارای معایبی نیز است از جمله می‌توان به عدم ناتوانی در مشخص کردن اندازه محصول بدون باز کردن سیستم و ناسازگار بودن برخی پلت فرم‌ها با شیمی برخی رنگ‌های فلورژنیک اشاره کرد. برای شناسایی بسیاری از ویروس‌های عامل بیماری‌های انسان از این روش استفاده شده است.
 
 ‏
 
Touch down PCR:  در این روش دمای آنیلینگ ازدمای بالاتر از Tm  بندرت کاهش می یابد وموجب کاهش  محصول کاذب و پرایمر دایمر می شود.
 
 
 
Long distance PCR: با این روش قطعات ببیش از ۲۰ kb همانند سازی میشوند. برای انجام این نوع PCR باید DNA  ژنومی از کیفیت بالایی برخوردار باشدو پرایمر ها  به دقت طراحی شوند. برای اینکاراز klon taq استفاده میشود.این آنزیم نسخه ای از DNA poly  است که قسمت N ترمینال آن حذف شده است و با pfu poly به نسبت ۱۸۰ به ۱ مخلوط میشود و فاقد ۵` اگزو نوکلئازی است.
 
 
 
Hot start PCR: عبارت است از جدا کردن یک یا چند ترکیب مهم PCR  ( ترجیحا" انزیم پلیمراز) بطوریکه بلا فاصله بعد ار دناتوراسیون DNA هدف به واکنش اضافه میشوند  ( استفاده از , PCR gem  و آنتی بادی آنزیم پلیمراز )
 
– Hot start  به کمک آنتی بادی : مونوکلونال آنتی بادی ضد آنزیم پلیمراز را به واکنش اضافه میکنند درنتیجه  فعالیت پلیمرازی آنزیم را مهار میکند. هنگامیکه دمای واکنش به ۹۴ درجه می رسد آتی بادی دناتوره می شود و دو باره  پلیمراز فعال می شود.
 
 – Hot start  به کمک Ampliwax : به دیواره لوله های محصوص اینکاربه نوعی واکس آغشته است که بعد از مختصری گرم کردن ذوب شده و روی ئاکنش را میپوشاند .  آنزیم پلیمراز را روی واکس قرار میدهند . در دمای ۹۴ درجه این واکس بخار میشود و آنزیم پلیمراز با واکنش تماس پیدا می کند.
 
PCR  با پرایمر های احتمالی   (Degeneracy  primer):
 
 این پرایمر ها بر اساس اطلاعات ترادف پروتئین یک ژن طراحی میشوند و بر اساس اسید های آمینه ای انجام میگیرد که دارای یک یا دو کدون باشند. پرایمر هایRAPD    – بنام پرایمر های اختیاری هم گفته میشوند . این پرایمر ها پلی مرفیسم را بدون شناخت توالی نوکلئوتیدی ردیابی می کنند .
 
 
 
 RFLP – PCR: در این روش ابتدا قطعه حاوی جایگاه چند شکلی را با واکنش زنجیره پلی مراز و استفاده از دو پرایمر مخصوص که به همین منظور طراحی شده تکثیر می نمایند و پس از هضم آنزیمی ، الکتروفورز می کنند . در PBR جهش هایی از نوع نقطه ای و حذف و اضافه که باعث تغییر در سطح قطعه آنزیمی می گردند قابل تشخیص است . در PBR تنوع در داخل منطقه ای که از دو طرف به پرایمر ختم شده تعیین می نمود که این ناحیه معمولا kb 5/0 است . ضمنا در PBR مزایایی چون سادگی ؛ سرعت زیاد ، عدم نیاز به مواد رادیواکتیو و تکرارپذیری بالا مطرح می باشد .
 
 
 
SSCP – PCR: زمانیکه DNA دو رشته ای در روی ژل الکتروفورز حرکت داده می شود ، حرکت DNA به اندازه قطعه بستگی دارد به طوریکه مولکولهای کوچک از منافذ ژل به آسانی عبور می کنند . در الکتروفورز SSCP ابتدا از یک ماده دناتوره کننده مانند اوره برای تبدیل DNA ود رشته ای به تک رشته ای استفاده می شود . در هنگام راندن DNA تک رشته در ژل اثر متقابل داخل مولکولی روی می دهد به عبارت دیگر DNA تک رشته قادر است در بخش هایی یا خود باند تشکیل دهد بنابراین حرکت مولکولها در این حالت بیشتر به ساختار مولکول DNA تک رشته نیز وابسته است ( ساختمان سرم )
 
ساختمان سوم در قطعه تک رشته وابسته به توالی کل قطعه است اگر جهش در توالی DNA رخ دهد ساختار قطعه تغییر می یابد و سرعت حرکت آن متفاوت از نوع وحشی است ، بنابراین قابل شناسایی است .
 
اگر پلی مورفیسم در قسم آغازین محصول PCR باشد شناسایی آن با SSCP بسیار راحت تر است .
 
 
 
DGGE – PCR: یکی از روش های مناسب برای آشکار سازی جهش ها است . این روس بر روی فرآورده های PCR صورت می گیرد در صورتیکه قطعات رشته DNA در یک نوکلئوتید با هم متفاوت باشند ، الگوی واسرتست شده متفاوتی را نشان می دهند . در این روش دو نمونه DNA دردو ستون جداگانه از یک ژل پل اکریلامید که دارای نسبتی از غلظت ماده و اسرتست کننده ( معمولا فرمامید ) است مورلاالکتروفورز قرار می گیرد . وقتی مولکولها به سطح بخرانی دناتوره می رسند دو رشته DNA شروع به جدا شدن می کنند . در این حالت کاهش معنی داری در حرکت قطعات ایجاد می شود . این نقطه به عنوان نقطه ذوب عمل می کند و باعث تاخیر در حرکت مولکلول DNA جهش یافته نسبت به فرم وحشی می گردد.
 
DGGE به موارد رادیواکتیو و مواد  شیمیایی سمی احتیاج ندارد ولی ابزار پیشرفته می خواهد . درصد تعیین موتاسوین در این روش خیلی نزدیک به ۱۰۰ % است . نوع مقابله ای از این روش TGGE می باشد که در آن از حرارت به جای غلظت مواد شیمیایی در ژل استفاده می شود . بهترین طول قطعات برای DGGE بین bp 1500-150 می باشد . برای واسرتست شدن کامل قطعات حاصل از زنجیره پلی مراز از یک ناحیه بالاترین دمای ذوب مصنوعی GC-clamp استفاده می شود.
 
Leave a Reply 25335 views, 12 so far today |
Follow Discussion

۲ Responses to “اصول‌ و مبانی PCR”

  1. samane Says:

    ba tashakor az matlab mofidetan…. faghat ye chizi inke ghalet negaresh daresh ziad bud

  2. حسین Says:

    با سلام ممنون از مطلب بسیار مفیدتان.موفق باشید

Leave a Reply

Time limit is exhausted. Please reload the CAPTCHA.

Gorgeous Gorgs, Sliema, December 24, 2016The 11:40 Rogue One Show on Eden in St Julian, December 28, 2016Ariëlla 006Lu #XAriëlla 005Surveillance Cat, St Julian, December 25, 2016x*y*z II1R8A87631R8A8711Strange small red house, Sliema, December 24, 2016