| Mobile | RSS

روش کشت گسترده – سطحی

مرداد ۲۵ام, ۱۳۹۰ | No Comments | Posted in محیط کشت

هدف از این آزمایش صحت سلامت کیک از میکروارگانیسم های مختلف است. ااز این روش در کارخانه های مواد غذایی نیز استفاده می شود تا از صحت سلامت محصول تولیدی خود اطمینان پیدا کنند.

 

تئوری آزمایش:

 

برای انجام این آزمایش به ابزار زیر نیازمندیم:

پلیت ، لوله آزمایش ، پیپت ، سرم فیزیولوژی ، محیط کشت PCA ، دستگاه کلونی کانتر ، انکوباتور ، نمونه ماده غذایی ، میله عصایی ، هاون چینی

 

روش کار:

در ابتدا از ماده غذایی جامد ( کیک ) نمونه گیری می کنیم ، به این صورت که از تمام نقاط مختلف آن باید نمونه برداری شود ( سطح رویی ، کناره ها ، سطح زیرین و داخل ). نمونه ها را در هاون چینی استریل با یکدیگر مخلوط و آسیاب می کنیم.

مقدار ۱ گرم از نمونه را برداشته و درون یک پلیت استریل می ریزیم ، مقدار ۹ cc سرم فیزیولوژی را نیز به آن اضافه می کنیم و آنرا با نمونه خوب مخلوط می کنیم تا کاملا یکنواخت شود. در واقع این مخلوط همان رقت ۱-۱۰ است. از این رقت سایر رقت ها را نیز تهیه می کنیم یعنی رقت های ۲-۱۰ و ۳-۱۰ .

از هر رقت دو پلیت را باید کشت داد. پلیت هایی که حاوی محیط کشت PCA  جامد هستند را از قبل علامت گذاری می کنیم( میزان رقت ، گروه و … ). با پیپت ۱cc  مقدار ۱/۰ cc از هر رقت را برداشته و در پلیت مربوط به آن رقت می ریزیم و با میله عصایی که استریل شده ، نمونه را بر سطح محیط کشت به طور یکنواخت پخش می کنیم.

پس از پایان این کار پلیت ها را در انکوباتور ۳۷ درجه به مدت ۴۸ ساعت قرار می دهیم تا کلونی ها به مقدار مطلوب رشد کنند. بعد از این مدت زمان پلیت ها از انکوباتور خارج می کنیم و تعداد کلونی ها را با دستگاه کلونی کانتر شمارش می کنیم.

 

( بخش شمارش کلونی ها و روش محاسبه در کشت گسترده با کشت پور پلیت یکسان است ، در واقع این روش برای شمارش کلونی ها ثابت است )

شمارش کلونی ها:

دو روش برای شمارش کلونی ها وجود دارد:

الف) دستگاه کلونی کانتر که به طور اتوماتیک تعداد کلونی ها را در یک رقت مشخص نشان می دهد.

ب) روش دستی که پلیت را به صورت وارونه بر روی یک صفحه سفید یا سیاه قرار داده و بین پلیت و صفحه یک شیشه شطرنجی قرار دارد و با علامت گذاری خانه ها تعداد را بدست می آوردند.

 

روش محاسبه:

الف) شمارش کلی میکروبی ( محاسبه استاندارد)← جهت شمارش پلیت هایی انتخاب شوند که بین ۳۰ تا ۳۰۰ کلونی داشته باشند که برابر میانگین تعداد کلونی های شمارش شده در دو پلیت ضرب در ضریب رقت بکار رفته.

ب) محاسبه تخمینی← اگر در تمام رقت ها بیش از ۳۰۰ کلونی در هر پلیت دیده شود ، سطح هر پلیت را به شعاع های مناسب تقسیم می کنیم و کلونی ها را در یک قسمت شمارش کرده و سپس تعداد کل را در ضریب مناسب ضرب می کنیم. میانگین شمکارش را در دو پلیت محاسبه و در ریب رقت ضرب و نتیجه را به عنوان تخمین شمارش کلونی گزارش می کنند.

 

شرح عملی آزمایش:

آزمایش را با نمونه گیری از نمونه که همان کیک بود آغاز کردیم ، بدین ترتیب که توسط کاتر استریل از تمام نقاط داخلی و سطحی نمونه برداشتیم. نمونه را درون هاون چینی استریل ریختیم ( هاون ها را با حرارت استریل کرده بودند و در آنها را ورق آلمینیومی پوشانده بودند ). نمونه کیک را به خوبی در کنار شعله آسیاب کردیم تا کاملا له شد و حالتی یکنواخت پیدا کرد. ۵ گرم از نمونه ای که با هاون له کرده بودیم را با ترازو وزن کردیم و داخل یک پلیت استریل ریختیم. مقدار وزن شده را دوباره به هاون چینی که خالی شده بود ریختیم و مقدار ۴۵ cc سرم فیزیولوژی به آن اضافه کردیم و آنها را در کنار شعله با هم کاملا مخلوط کردیم تا به صورت یکنواخت در آمد. این ترکیب رقت ۱-۱۰ است. ( گروه ما برای تمام گروه ها این رقت را تهیه کرد وگرنه هر گروه باید ۱ گرم نمونه را با ۹ cc سرم فیزیولوژی مخلوط می کرد تا رقت ۱-۱۰ را بسازد ). باید سعی شود تمام این مراحل کنار شعله انجام شود و حد الامکان از برداشتن کامل درب آلمینیومی هاون چینی خودداری کنیم زیرا ممکن است در غیر این صورت میکروارگانیسم های دیگری نیز روی پلیت ها رشد کند. ( چون این آزمایش فرضی است رقت آماده شده توسط مسئول آزمایشگاه به یک میکروارگانیسم، آلوده شد )

از رقت بدست آمده سایر رقت ها را می سازیم. ۱ cc از رقت ۱-۱۰ بر می داریم و همراه با ۹ cc سرم فیزیولوژی درون یک لوله آزمایش می ریزیم که رقت ۲-۱۰ را به ما می دهد و از این رقت نیز مقدار ۱ cc را بر می داریم و همراه با ۹ cc سرم فیزیولوژی درون یک لوله آزمایش دیگر می ریزیم. روی هر لوله رقت مربوطه را می نویسیم.

بعد از آنکه تمام رقت ها را آماده کردیم ، نوبت به کشت آنها می رسد. پلیت های حاوی محیط کشت PCA را که از قبل آماده بود را شماره گذاری کردیم که برای هر رقت دو پلیت نیاز بود.

از هر رقت ۱/۰ cc با پیپت بر داشتیم و روی سطح پلیت مربوطه ریختیم. برای آنکه تعداد کمتری پیپت استفاده شود از رقت ۳-۱۰ شروع به این کار کردیم. پس از این کار باید با میله عصایی نمونه را روی سطح پلیت پخش کنیم. برای این کار باید میله عصایی را استریل کنیم به این ترتیب که میله را درون الکل ۹۶%  فرو می کنیم و بعد الکل را با شعله می سوزانیم. این کار را باید برای هر رقت انجام داد ولی برای رقت یکسان لازم نیست اما بهتر است انجام گیرد. در انجا باید دقت شود میله عصایی با حرارت داغ نشود که موجب از بین رفتن میکروارگانیسم ها شود.

پس از این کار پلیت ها را روی هم چیدیم و با چسب فیکس کردیم و درون انکوباتور ۳۲ درجه به مدت ۴۸ ساعت قرار دادیم. در این مدت کلونی ها به اندازه کافی رشد کردند و با دستگاه کلونی کانتر آنها را شمارش کردیم و نتیجه آن به صورت زیر است.

 

 

 

 

Leave a Reply 8986 views, 1 so far today |

Leave a Reply

Time limit is exhausted. Please reload the CAPTCHA.

Gorgeous Gorgs, Sliema, December 24, 2016The 11:40 Rogue One Show on Eden in St Julian, December 28, 2016Ariëlla 006Lu #XAriëlla 005Surveillance Cat, St Julian, December 25, 2016x*y*z II1R8A87631R8A8711Strange small red house, Sliema, December 24, 2016