| Mobile | RSS

استخراج اسیدهای نوکلئیک

تیر ۱۰ام, ۱۳۹۰ | No Comments | Posted in میکروبیولوژی

همان طور که می دانید همه سلول های هسته دار دارای ماده ژنتیک هستند بنابراین از نمونه خونی و یا هر نمونه بافتی می توانیم DNA را استخراج کنیم . برای استخراج DNA  مقدار ۳ میلی لیتر از خون  EDTA لازم است . همان طور که اطلاع دارید DNA در داخل هسته با پروتئین هایی مخلوط شده و تشکیل کروماتین را می دهند برای جداسازی ماده ژنتیک باید این پروتیئن ها را جدا سازی کرد . این کار را با استفاده از محلول های الی و یا نمکها انجام می دهند . بعد از این مرحله DNA را با رسوب اتانول خالص سازی می کنند . امروزه کیت های زیادی برای جداسازی DNA در بازار وجود دارد ولی ادامه این روش ها ممکن است تشخیص مولکولی را به مشکل برساند.

 

آماده سازی محلول استوک

در تست استخراج dna پیشنهاد می شود که از با کیفیت ترین کیت ها  استفاده شود همچنین از اب مقطر دو بار تقطیر شده باید استفاده کنیم .

  1. NaCl 5 mol/l : برای این منظور مقدار ۱۴۶٫۱ گرم از سود را در بالن ژوژه ای با اب مقطر حل کرده و به حجم ۵۰۰ میلی لیتر می رسانیم .
  2. Tris-HCl, 1 mol/l, pH 8: مقدار ۶۰٫۵ گرم از Trizma base (tris[hydroxy]methylaminomethane) را در ۳۵۰ میلی لیتر از اب مقطر حل می کنیم . سپس به محلول hcl اضافه می کنیم تا مقدار ph به ۸٫۸ برسد . سپس حجم محلول را با افزودن اب به ۵۰۰ میلی لیتر می رسانیم .
  3. Tris-HCl, 1 mol/l, pH 7.4 : برای این منظور هم طبق بالا محلول را تهیه می کنیم ولی با افزودن hcl مقدار ph را به ۷٫۴ می رسانیم .
  4. NaOH, 5 mol/l : دویست گرم از NAOH را با  800 میلی لیتر اب مقطر حل می کنیم (دقت کنید  که ! باید به خوبی حل کنیم . ) . سپس با اب مقعطر ان را به حجم یک لیتر می رسانیم .
  5. EDTA, 0.5 mol/l, pH 8.0 : مقدار ۹۳ گرم از EDTA دهیدارته دی سدیم را با ۴۰۰ میلی لیتر از اب مقطر مخلوط می کنیم . باید دقت کنیم که تمام ماده حل شده باشد . سپس ۰٫۵ mol/l NaOH را تا رسیدن به PH هشت در داخل محلول می ریزیم . سپس محلول را به حجم ۵۰۰ میلی لیتر می رسانیم .
  6. Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.3
  7. Nonidet P-40 (NP40), 10%. ده میلی لیتر از NP40 را با ۹۰ میلی لیتر از اب مقعطر به خوبی مخلوط می کنیم .
  8. Sodium dodecyl sulphate (SDS, lauryl sulphate), 20% : صد گرم SDS  را با ۳۵۰ میلی گرم اب به حجم می رسانیم . سپس در دمای ۶۵ درجه حرارت می دهیم تا به خوبی حل شود سپس حجم را به ۵۰۰ می رسانیم .
    دقت کندی که SDS یک ترکیب محرکه تنفسی است و در زمان ازمایش باید از ماسک استفاده کرد و محلول را در زیر هود تهیه می کنیم .

محلول کار :

  1. PBS + 0.1% NP40 : مقدار ۵ میلی لیتر از ۱۰% NP40 را در  495 میلی لیتر از PBS  حل می کنیم .
  2. (Ten times concentrated (×10) lysis buffer): برای تهیه بافر  لیز کننده ابتدا ۶۰ ml of 5 mol/l NaCl, 20 ml of 0.5 mol/l EDTA, 10 ml of 1 mol/l Tris pH 7.4   و ۱۰ میلی لیتر اب مقطر را با هم مخلوط می کنیم تا ۱۰۰ ml of 3 mol/l NaCl, 100 mmol/l EDTA,  و ۱۰۰ mmol/l Tris به دست اید .
  3. Lysis solution : این محلول را باید همان روز مورد مصرف قرار داد . ۷ mol/l از اوره را با ۵ میلی لیتر از بافر بالایی مخلوط می کنیم سپس حجم را به ۵۰ میلی لیتر می رسانیم .
  4. Chloroform/isoamyl alcohol (24:1): مقدار ۲۰ میلی لیتر از isoamyl alcohol را به ۴۸۰ میلی لیتر از کلروفروم اضافه می کنیم .
  5. Ethanol 70% : برای تهیه این محلول هم (همان طور که دوستان بهتر از ما اطلاع دارند!) ۳۰ میلی لیتر از اب مقطر را به ۷۰ میلی لیتر الکل مطلق اضافه می کنیم .
  6. Tris EDTA (TE) (10 mmol/l Tris, 1 mmol/l EDTA). : مقدار ۵ ml of 1 mol/l Tris pH 7.4را با ۱ ml of 0.5 mol/l Na2 EDTA مخلوط می کنیم سپس  به حجم ۴۹۴ می رسانیم .
  7. TE equilibrated phenol : میزان فنول برای به دست اوردن DNA بسیار مهم است . DNA در ترکیب اسیدی فنول محلول است پس لازم است تا PH ان به PH  طبیعی نزدیک باشد . برای تهیه آن از روش زیر باید استفاده کنیم :
  8. Take 500 ml of water-saturated phenol. Prepare 500 ml of 0.5 mol/l Tris pH 8.5, add 150 ml of this to the phenol, and mix by inversion for 2–3 min. Leave to stand until the aqueous and organic phases have separated.
  9. Remove and discard the upper aqueous layer. Add another 125 ml of 0.5 mol/l Tris, mix, stand, remove the aqueous layer as before, and then repeat.
  10. To the remaining 100 ml of 0.5 mol/l Tris, add 400 ml of water to give 500 ml of 0.1 mol/l Tris. Add 150 ml of this to the phenol, and then mix, stand, and remove. Repeat two more times.
  11. To the remaining 50 ml of 0.1 mol/l Tris add 449 ml of water and 1 ml of 0.5 mol/l EDTA to give 500 ml of TE. Add, mix, stand, and remove this in three stages as before. The phenol will have reduced in volume during this procedure but is now TE equilibrated and ready for use.

 

نگه داری نمونه | نمونه خونی حاوی ضد انعقاد را در دمای -۲۰ درجه سانتی گراد فریز می کنیم . EDTA ضد انعقاد مناسبی است . نمونه خون را باید در تیوبی جمع اوری کنیم که قابل سانتریفیوژ باشد (مانند تیوب های ۲۵ میلی لیتری یکبار مصرف) . تمام تیوب ها در رنج ۲ تا ۲۰ میلی لیتر رضایت بخش است . خون را میتوان در دمای اتاق برای انتقال به ازمایشگاه رفرانس نگه داری کرد . ترجیحا در عرض چند روز بعد از خون گیری باید این کار انجام شود . نمونه را میتوان در دمای -۲۰ درجه تا چند هفته نگه داری کرد . برای نگه داری بیشتر دمای -۸۰ درجه سانتی گراد مناسب است .

استخراج اسیدهای نوکلئیک

نخستین گام در بررسی مولکولی ساختار ژنتیک سلول ها دسترسی به ماده ژنتیک می باشد. اصول استخراج ماده ژنتیک از سلول های مختلف (باکتری ها، سلول های گیاهی و سلول های جانوری) نسبتا یکسان است و تنها در برخی از جزئیات تفاوت هائی وجود دارد. استخراج اسید های نوکلئیک شامل دو مرحله تهیه عصاره سلولی و خالص سازی می باشد.

تهیه عصاره سلولی

برای تهیه عصاره سلولی به تعداد زیادی سلول نیاز است. عموما سلول ها با تکثیر در محیط کشت و یا مستقیما از بافت ها (مانند بافت خون) تأمین می شوند. سپس باید دیواره و غشاء سلول ها از بین بروند تا محتویات آنها آزاد شوند. برای تخریب دیواره یا غشاء سلولی، روش های فیزیکی و شیمیایی مختلفی بکار می رود. از روش های فیزیکی می توان به شوک اسمزی، سائیدن سلول های یخ زده و استفاده از امواج صوتی یا سونیکیشن اشاره کرد. در سونیکیشن، طول موج و شدت امواج صوتی به کار گرفته شده به نوع سلول و کاربردی که از عصاره سلول مورد نظر است، بستگی دارد. در روش های شیمیایی از آنزیم ها و موادی که باعث تخریب دیواره و غشاء می شوند استفاده می شود. برای مثال، برای شکستن دیواره باکتری ها از آنزیم لیزوزیم یا اتیلن دی آمین تتراستات (EDTA) یا مخلوطی از آنها استفاده می شود. لیزوزیم با عمل آنزیمی خود باعث تجزیه پپتیدو گلیکان دیواره سلولی می شود و EDTA با حذف یون های فلزی مانند Ca2+ و Mg2+ که در استحکام دیواره نقش دارند، دیواره را سست می کند. به علاوه EDTA با حذف یون های فلزی که به عنوان گروه پروتستتیک در آنزیم های تجزیه کننده اسیدهای نوکلئیک عمل می کند، مانع تجزیه این مواد می شود.

در سلول های جانوری بعلت فقدان دیواره سلولی، با یک شوک اسمزی ساده می توان غشاء سلول ها را شکست. با این حال اغلب از موادی مانند سدیم دود سیل سولفات (SDS)، دو دسیل سارکوزین و تریتون X100 که غشا را در خود حل می کنند، استفاده می شود. SDS همچنین باعث پایداری اسیدهای نوکلئیک می شود. مراحل تهیه عصاره سلولی باید در محلول های محافظت کننده اسیدهای نوکلئیک که معمولا حاوی بافر تریس هیدروکلرید، SDS و EDTA است انجام شود تا کمترین آسیب به ماده ژنتیک برسد.

برای استخراج ماده ژنتیک سلول های انسانی، معمولا از سلول های سفید خون که یک تا سه ساعت مانده اند یا خون منجمد، سلول های کشت یافته مانند کشت فیبروبلاست ها، کشت سلول های پرزهای جنینی (CVS) یا کشت سلول های مایع آمنیوتیک استفاده می شود.

 

خالص سازی DNA

برای خالص سازی DNA برحسب نوع سلول و کاربرد مورد نظر، روش های مختلفی ابداع شده است. روش های مزبور از اصول یکسانی تبعیت می کنند که شامل رسوب دادن مرحله به مرحله ناخالصی ها و استخراج DNA خالص می باشد. در این روش ها ابتدا با کمک مواد واسرشت کننده پروتئین ها نظیر فنل، این مواد از عصاره سلولی حذف می شوند. سپس DNA در فاز قطبی (آبی) بصورت محلول استخراج می شود. اگر مقدار پروتئین ها زیاد باشد می توان قبل از مرحله فوق پروتئین ها را با آنزیم های تجزیه کننده مانند پروتئیناز k تجزیه و حذف نمود.

پس از جدا کردن فاز آبی، می توان با اضافه کردن الکل هائی نظیر اناتول یا ایزو پروپانول در حضور کاتیون Na+ یا آمونیوم، اسیدهای نوکلئیک را رسوب داد. در سلول های گیاهی و سلول های بافت کبد که مقدار هیدرات های کربن زیاد است برای خالص سازی اسیدهای نوکلئیک از CTAB و محلول نمک استفاده می شود. این محلول فقط باعث رسوب اسیدهای نوکلئیک می شود و پلی ساکاریدها بصورت محلول باقی می مانند. رسوبی که به روش های فوق بدست می آید حاول مخلوطی از RNA و DNA است. برای خالص سازی DNA می توان با اضافه کردن ریبونوکلئاز، RNA را هیدرولیز کرده و DNA خالص بدست آورد.

امروزه شرکت های مختلف تهیه کننده مواد بیولوژی مولکولی اقدام به تهیه کیت هایی برای استخراج اسید های نوکلئیک از منابع مختلف سلولی نموده اند که در صورت عدم وجود محدودیت مالی در آزمایشگاه می توان با استفاده از کیت های مزبور در مدت زمان کم و با بازده نسبتا بالائی اقدام به تهیه اسید های نوکلئیک با درجه خلوص بالا نمود. به علاوه سیستم های روبوتیک مختلفی اختراع شده اند که روزانه قادر به استخراج هزاران نمونه از اسید های نوکلئیک از نمونه های مختلف میکروبی، گیاهی و حیوانی می باشند.

 

روش های الکتروفورز در بیولوژی مولکولی

پس از استخراج ماده ژنتیک، مرحله بعدی تفکیک آن به قطعات تشکیل دهنده و شناسایی هر قطعه می باشد. همچنین در هنگام بررسی پروتئین های سلولی نیز نیاز به تفکیک انواع پروتئین ها از هم می باشد. به سبب اینکه ماکرو مولکول های زیستی باردار هستند، می توان با قرار دادن آنها در یک میدان الکتریکی، آنها را بر اساس خواص فیزیکی مانند شکل فضایی، وزن مولکولی و بار الکتریکی، تفکیک کرد. برای این منظور از روشی بنام الکتروفورز استفاده می شود. روش های مختلف الکتروفورزی برای تفکیک و مطالعه بیومولکول ها اعم از اسید های نوکلئیک یا پروتئین ها ابداع شده است که در زیر به معرفی انواع متداول آن می پردازیم:

۱- الکتروفورز سطحی: از یک نوار کاغذی یا استات سلولزی بعنوان فاز ثابت استفاده می شود. دو روش فوق جز در برخی کارهای پژوهشی کاربرد چندانی ندارند.

۲- الکتروفورز ژل: از یک محیط نیمه جامد (ژل) بعنوان فاز ثابت استفاده می شود. این نوع الکتروفورز بر حسب نوع ژل به کار گرفته شده به دو نوع الکتروفورز ژل پلی اکریل آمید (PAGE) و الکتروفورز ژل آگاروز تقسیم می شود. الکتروفورز PAGE دارای قدرت تفکیک بسیار بالائی بوده و برای تفکیک پروتئین ها و اسید های نوکلئیک به کار گرفته می شود.

به منظور بررسی پروتئین ها با استفاده از PAGE، به سبب اینکه پروتئینها دارای بار مختلف هستند، معمولا برای اینکه تفکیک فقط بر اساس وزن مولکولی انجام شود، به بافر ماده شیمیائی، SDS سدیم دو دسیل سولفات اضافه می شود. SDS مولکول بزرگی با بار منفی می باشد. این ماده باعث واسرشت شدن پروتئین ها شده و به آنها متصل می شود. به ازای هر دو اسید آمینه، یک مولکول SDS به پروتئین متصل می شود که باعث القاء بار منفی متناسب با وزن مولکولی به پروتئین می شود. هر چه غلظت پلی اکریل آمید بیشتر باشد، قدرت تفکیک ژل بیشتر خواهد بود و مولکول های دارای وزن مولکولی نزدیک به هم را بهتر تفکیک می نماید.

برای تفکیک اسیدهای نوکلئیک در صورت امکان از ژل آگاروز استفاده می شود. تهیه ژل مزبور به مراتب سریع تر و آسان تر از ژل پلی اکریل آمید بوده و هزینه کمتری را در بر می گیرد. معمولا برای تفکیک قطعات بزرگ دی ای آ (بزرگتر از ۵۰۰ جفت باز) در صورتیکه هدف صرفا بررسی کیفی و تفکیک باشد، استفاده از ژل آگاروز انتخاب اول است. برای تفکیک قطعات کوچک DNA دو رشته ای و قطعات DNA تک رشته ای از ژل پلی اکریل آمید استفاده می شود. قدرت تفکیک ژل های مزبور ارتباط مستقیمی با غلظت آنها دارد. برای مثال، برای تفکیک قطعاتی به اندازه ۱۰۰ جفت باز از آگاروز ۳% و برای قطعات حدود ۲۰۰۰ جفت باز از آگاروز ۸/. درصد استفاده می شود. در صورتیکه نیاز به تفکیک DNA به صورت تک رشته ای باشد، از مواد واسرشت کننده نظیر اوره، فرمالدهید یا فرمامید در ژل همزمان با الکتروفورز استفاده می شود. به این نوع ژل ها، ژل واسرشت کننده می گویند. چنین ژل هائی پیچ و تاب های اسید های نوکلئیک را از هم باز کرده و بنابراین تفکیک مولکول ها فقط براساس طول و نه ساختار دوم انجام می شود. در این ژل ها مولکول های کوچکتر در مقایسه با مولکول های بزرگتر سریع تر حرکت کرده و مسافت بیشتری را طی می کنند. از روش PAGE برای بررسی موتاسیون ها و تعیین توالی DNA استفاده می شود.

۳- الکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان دار: چنانچه اشاره شد، هر چه غلظت ژل کمتر باشد با آن می توان مولکول های بزرگتری را بوسیله الکتروفورز، تفکیک کرد. ولی در این رقت محدودیت وجود دارد به طوریکه حتی با رقیق ترین ژل های آگاروز هم نمی توان مولکول های DNA بزرگتر از ۱۰۰ کیلو جفت باز را تفکیک کرد. برای این منظور از روش های الکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان دار استفاده می شودکه دارای انواع مختلفی است:

الف: الکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان دار تک جهتی (UPFGE): یکی از ساده ترین روش های الکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان دار، روش UPFGE می باشد. برای این روش از یک دستگاه ژل الکتروفورز افقی معمولی استفاده می شود. در UPFGE، میدان الکتریکی در فواصل زمانی معین قطع شده و دوباره برقرار می شود. هنگامی که میدان برقرار است مولکول DNA بصورت گسترده در آمده و در جهت میدان حرکت می کند. با قطع شدن جریان الکتریکی، حرکت DNA متوقف شده و DNA فرصت می یابد تا به حالت هیئت فضایی خاص خود در آید، ولی با برقراری مجدد جریان، حرکت مولکول آغاز می شود. در زمانی که میدان الکتریکی برقرار نیست، همه مولکول ها فرصت نمی کنند بطور کامل به شکل فضایی خود در آیند. هر چه مولکول کوچک تر باشد، سریع تر می تواند به شکل فضایی خود در آید و از آن خارج شود. براین اساس می توان مولکولهای نسبتا بزرگ را از هم تفکیک کرد. با استفاده UPFGE می توان مولکولهایی تا اندازه ۴۰۰ کیلو جفت باز را از هم تفکیک کرد. از این روش الکتروفورزی در آنالیز ژن های بزرک نظیر ژن کد کننده پروتئین دیستروفین که در پیدایش بیماری دیستروفی عضلانی نقش دارد، استفاده می شود.

ب: الکتروفورز در میدان الکتریکی معکوس (FIGE): در روش FIGE، جهت میدان الکتریکی در فواصل زمانی معین، معکوس می شود. در این روش برای تفکیک مولکول های کوچک از دامنه های زمانی کم استفاده می شود، یعنی میدان الکتریکی بطور متناوب به مدت ۵/. ثانیه در جهت مستقیم و به مدت ۲۵/. ثانیه در جهت مخالف برقرار می شود. در مورد مولکول های بزرگتر از زمان های بیشتر، ۳ ثانیه به جلو و ۱ ثانیه در جهت مخالف استفاده می شود. با این روش می توان مولکول هایی تا اندازه ۸۰۰ کیلو جفت باز را از هم تفکیک کرد.

ج: ژل اکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان دار (PFGE): این روش یکی از متداول ترین روشهای الکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان دار است. در این روش از دو میدان الکتریکی که نسبت بهم بصورت عمود قرار گرفته اند، در فواصل زمانی معین بطور متناوب استفاده می شود. یکی از این میدان ها در جهت بالا به پائین و دیگری در جهت چپ به راست قرار دارد. مولکول های DNA پس از آنکه تحت تأثیر میدان اول حرکت کردند، در اثر میدان دوم، ۹۰ درجه تغییر جهت داده و حرکت می کنند. در اثر این روش مولکول های DNA با یک حرکت چرخشی خود، در طول ژل بصورت زیگ زاگ حرکت می کنند. در روش PFGE می توان مولکول های بسیار بزرگی در اندازه بین ۲۰ هزار تا ۲ میلیون جفت باز را از هم تفکیک کرد.

 

روش های مختلف رنگ آمیزی گسترش های خونی

در آزمایشگاه های بیولوژی سلولی که هدف فقط مشاهده گلبول های سفید می باشد، با هر رنگی که بتواند هسته یا میتوکندری را رنگ کند، مانند سبز ژانوس و لازارو، می توان گلبول های سفید را رنگ آمیزی کرد.

اما در آزماشگاه های هماتولوژی که هدف شناسایی ناهنجاری های گلبول های سفید (مانند شناسایی سلول های لوکمیایی) است معمولا بصورت استاندار از روش های زیر استفاده می شود:

۱- روش های گیمسا Giemsa

۲- روش رایت Wright Stain

۳- رنگ آمیزی با برلیان کرزیل بلو Brilliant Cresyl Blue

۴- رنگ آمیزی با Aniline blue

۵- روش Papanicolaou (برای اطلاعات بیشتر در مورد این روش، به روش پاپا نیکولائو مراجعه کنید.)

۶- استفاده از محلول ائوزین متیلن بلو می گران والد، May-Grünwald´s eosin methylene blue solution

۷- روش های آنزیمی: در این روش ها، گلبول های سفید بعلت حضور حضور آنزیم های خاصی در آنها شناسایی می شوند.

بر خی از این آنزیم ها عبارتند از:

الف: آنزیم پراکسیداز در گرانولوسیت ها

ب: آنزِیم آلکالین فسفاتاز

ج: آنزیم نفتیل استات استراز

 

DNA and General PCR Methods

۱٫ preparation of vector:
۱٫۱٫ vector: _________
۱٫۲٫ vector resistance: _________
۱٫۳٫ vector size: _______ kb
۱٫۴٫ vector was:
۱٫۴٫۱٫ ___ double digested with ____ units or ___ ul of REN _____ and untis or ___ ul of REN _____ in ______ buffer
۱٫۴٫۲٫ ___ sequential digested in a total volume of ____ ul first with ____ units or ___ ul of REN _____ and then with untis or ___ ul of REN _____ adding ____ buffer
۱٫۴٫۲٫۱٫ vector was purified by ___ column; ___ agarose gel
۱٫۴٫۳٫ ___ dephosphorylated; ___ not dephosphorylated
۱٫۴٫۳٫۱٫ vector was purified by ___ column; ___ agarose gel

۲٫ preparation of insert:
۲٫۱٫ insert size: _______ bp
۲٫۲٫ insert was:
۲٫۲٫۱٫ ___ PCR amplified with primers including REN sites _____ and _____
۲٫۲٫۱٫۱٫ insert was purified after PCR by ___ column; ___ agarose
۲٫۲٫۲٫ cut out of another vector by REN ___ double digest; ___ sequential digest in a total volume of ____ ul with ____ units or ___ ul of REN _____ and untis or ___ ul of REN _____
۲٫۲٫۲٫۱٫ insert was purified after digest by ___ column; ___ agarose
۲٫۲٫۳٫ ___ PCR amplified and treated to create blunt ends by _____; subsequent digested by REN _____ to create one sticky end
۲٫۲٫۳٫۱٫ insert was purified after digest by ___ column; ___ agarose

۳٫ ligation set up:
۳٫۱٫ ratio of vector : insert is ___ : ___
۳٫۲٫ concentration of vector : insert is ____ ng : ____ ng
۳٫۳٫ ligation was done in ___ ul total volume @ ___ ºC for ___ o/n; ___ hrs

۴٫ transformation:
۴٫۱٫ transformation is done by ___ calciumchloride/heat shock; ___ electroporation with bacteria strain _________
۴٫۲٫ transformation set up included following controls:
۴٫۲٫۱٫ ___ positive control; a known unaltered plasmid (expect a lot of colonies)
۴٫۲٫۲٫ ___ negative control; linearized vector submitted to ligation
۴٫۲٫۲٫۱٫ ___ dephosphorylated (expect no colonies)
۴٫۲٫۲٫۲٫ ___ not dephosphorylated
۴٫۲٫۲٫۲٫۱٫ ___ expect lots of colonies if both ends are blunt, same REN site or have same overhangs
۴٫۲٫۲٫۲٫۲٫ ___ expect no/few colonies if both ends have different REN sites
۴٫۳٫ ___ bacteria were regenerated @ 37ºC in _______ media
۴٫۴٫ bacteria were streaked out on _______ plates

۵٫ results:
۵٫۱٫ ______ colonies for positive control
۵٫۲٫ ______ colonies for negative control
۵٫۳٫ ______ colonies for cloned vector

Leave a Reply 14231 views, 3 so far today |

Leave a Reply

Time limit is exhausted. Please reload the CAPTCHA.

1R8A94601R8A94661R8A93781R8A9319Ryan's Pub, St Julian, December 25, 2016Gorgeous Gorgs, Sliema, December 24, 2016The 11:40 Rogue One Show on Eden in St Julian, December 28, 2016Ariëlla 006Lu #XAriëlla 005