| Mobile | RSS

کشت و بررسی کلی فرم ها

تیر ۲۱ام, ۱۳۹۰ | No Comments | Posted in باکتری شناسی

معرفی کلی فرم ها:

مهمترین عضو گروه کلی فرم ها اشرشیا کلی می باشد. اشرشیا کلی در انتهای روده تمام حیوانات خون گرم وجود دارد ولی در روده حیوانات خونسرد معمولا یافت نمی شود. تعداد این میکروارگانیسم ها در معده و قسمتابتدایی روده ها کم و یا اصولا وجود ندارد. اشرشیا کلی در روده حیوانات گوشتخوار و همچنین انسان و میمون بیش از روده علف خواران وجود دارد و مدفوع گاو و اسب خیلی کمتر از مدفوع انسان حاوی این میکروب می باشد.

برخی از سوش های اشرشیا کلی غالبا بی ضرر هستند و برخی دیگر می توانندبه دلیل خصوصیات آنتی ژنی که دارا هستند برای انسان و حیوانات بیماریزا باشند.

بنابراین آن دسته از اشرشیا کلی هایی که ظاهرا بی آزار هستند ، خارج از محیط طبیعی خود می توانند ایجاد اختلالاتی نمایند و از همین جهت به آنها فرصت طلب می گویند.

وجود کلی باکتری ها در مواد غذایی نامطلوب است و باعث خطر آلودگی ماده غذایی به باکتری های بیماری زای روده ای می شود. انواع بیماری زای آن دارای پیلی و کپسول هستند و کد ژنتیکی آنها در پلاسمید است. از این جهت برای تعیین کیفیت بهداشتی مواد غذایی ، بخصوص آب و شیر ، اشرشیا کلی به عنوان شاخص بهداشتی پیشنهاد شده و تقریبا مورد قبول همگان نیز قرار گرفته است.

اشرشیا کلی ها باکتری هایی از راسته ی انتروباکتیالس و تیره ی انتروباکتراسه و جنس کلی فرم ها می باشند. باکتری گرم منفی و میله ای می باشد که طول آن به ۱ تا ۳ میکرون می رسد و در محیط های آزمایشگاهی به خوبی رشد می کند.

برای تشخیص آلودگی مواد غذایی به اشرشیا معمولا از محیط های کشت رنگی و دارای خاصیت باکتریو استاتیکی استفاده می شود ، مانند محیط کشت مک کانکی و محیط کشت EMB دارای رنگ سبز متالیک.

به طور کلی ، چهار دسته از سوش های E.coli می تواند سبب ایجاد مسمومیت های غذایی شوند که عبارتند از:

  1. انترو پاتوژنیک اشرشیا کلی ( EPEC )
  2. انترو توکسیژنیک اشرشیا کلی ( ETEC )
  3. انترو اینویسیو اشرشیا کلی ( EIEC )
  4. انترو هموراژیک اشرشیا کلی ( EHEC )

جنس دیگری از کلی فرم ها ، انتروباکتر ( یا آئروباکتر ) است. این باکتری ها لوله ای و گرم منفی هستند و می توانند در بیشتر محیط های کشت رشد کنند. می توانند گلوکز و لاکتوز را با تولید اسید و گاز تخمیر کنند( در حین تخمیر گاز انیدریدکربنیک را دو برابر گاز هیدروژن تولید می کنند). در حین سوخت و ساز مواد بیشتر بوی نامطبوع و حالت لزج و چسبنده ای را در سطح مواد بوجود می آورند.

در محیط کشت کلی فرم ها از لاکتوز استفاده می شود زیرا کلی فرم ها دارای آنزیم بتا گالاکتوزید آز می باشند ، در حالی که بیشتر باکتری هایی که منشا آب یا خاک دارند فاقد این آنزیم هستند. پس به این طریق می توان یک محیط افتراقی را بوجود آورد. 

حال اگر بخواهیم اشرشیا کلی و انتروباکتر ها را از هم تمییز بدهیم ، اولین نشانه تولید گاز در لوله های دورهام ، حین کشت در محیط لاکتوزپپتون است زیرا انتروباکتر ها تقریبا دو برابر اشرشیا کلی تولید گاز می کند. اما برای تشخیص دقیق آنها باید از روش های دیگر استفاده کرد. مثلا بر اثر کشت اشرشیا کلی در محیط EMB کلونی هایی با رنگ سبز آبی با درخشش متالیک بوجود می آید درحالی که کلونی های انتروباکتر در همین محیط کشت صورتی رنگ و بدون درخشش است. اما برای تشخیص بهتر آنها از هم ، از آزمایش های بیوشیمیایی مانند آزمایش های IMVIC استفاده می شود.

در اینجا ما قصد داریم تا مواد غذایی را از نظر وجود کلی فرم ها بررسی کنیم. برای این کار از محیط های کشت مختلفی استفاده می کنیم و در آخر باکتری ها را با میکروسکوپ بررسی می کنیم.

تئوری آزمایش:

برای انجام این آزمایش به ابزار و وسایل زیر احتیاج داریم:

لوله آزمایش درب دار ، آنس حلقوی ، پیپت ، محیط کشت ( سبز درخشان ، EMB ، VRBA، BPLS ) ، نمونه ی آبمیوه آلوده ، سرم فیزیولوژی.

 

ابتدا ۹ لوله آزمایش را به مقدار ۷ cc از محیط کشت سبز درخشان پر می کنیم و درون هر لوله یک لوله درهام به صورت برعکس قرار می دهیم( لوله آزمایش را بر می گردانیم تا هوا از درهام خارج شود ). 

باید رقت های ۱-۱۰ و ۲-۱۰ را از نمونه ی آبمیوه تهیه و از رقت دوم برای کشت استفاده کنیم. مقدار ۹ cc سرم فیزیولوژی را درون یک لوله آزمایش می ریزیم و ۱ cc از نمونه ی آبمیوه نیز به آن اضافه می کنیم. محتوای این لوله رقت ۱-۱۰ است . برای رقت دوم ۴۵ cc سرم فیزیولوژی را درون یک ارلن و ۵ cc از رقت ۱-۱۰ را درون ارلن می ریزیم. حال که رقت ۲-۱۰ ما آماده شد می توانیم کشت را آغاز کنیم.

برای انجام این کشت ابتدا لوله ها را سه تا سه تا دسته بندی می کنیم ، زیرا باید درون یک دسته ۱۰ cc و در دسته ی دیگر ۱cc و در دسته ی آخر ۰٫۱ cc از رقت ۲-۱۰ بریزیم.

بعد از اینکه مقدار رقت های مربوطه را به لوله ها اضافه کردیم ، درب لوله ها را می بندیم و درون انکوباتور ۳۷ درجه به مدت ۴۸ می گذاریم.

نوبت به کشت نمونه ی آبمیوه روی محیط های EMB و VRBA و BPLS می رسد. برای این کار از روش کشت خطی استفاده می کنیم. آنس حلقوی استریل شده را درون نمونه ی آبمیوه فرو می کنیم و با همان روی محیط کشت می دهیم. برای هر سه پلیت حاوی محیط های ذکر شده همین کار را تکرار می کنیم. در آخر پلیت ها را درون انکوباتور ۳۷ درجه به مدت ۴۸ ساعت می گذاریم.

بعد از گذشت مدت زمان ذکر شده لوله ها و پلیت ها را از انکوباتور خارج می کنیم. لوله های حاوی محیط کشت سبز درخشان را از لحاظ تشکیل گاز درون لوله درهام بررسی می کنیم. برای هر لوله ای که گاز درون لوله درهام تشکیل شده بود ، مثبت می گذاریم و در آخر تعداد مثبت ها را برای هر دسته یادداشت می کنیم و از جدول بیشترین تعداد احتمالی MPN)) باکتری با ۹۵% حدود اطمینان میزان آلودگی را اعلام می کنیم.

پلیت ها را از نظر تشکیل کلونی بررسی می کنیم. تمام کلونی های تشکیل شده کلی فرم است زیرا درون این محیط ها عامل محدود کننده وجود دارد.

برای مشاهده باکتری ها با میکروسکوپ از رنگ آمیزی گرم استفاده می کنیم.

 

شرح آزمایش:

 تمام مراحلی را که در آزمایشگاه انجام دادیم مانند تئوری است که توضیح داده شد. (حتی مقادیر مواد مورد استفاده نیز مانند تئوری بود).

اعداد مربوط به محیط کشت سبز درخشان که به ما ارائه شد در جدول زیر آمده و طبق این اعداد از روی جدول مربوطه در دستور کار میزان آلودگی را در زیر یادداشت کرده ایم.

 

۱۰ cc

۱ cc

۰٫۱cc

مقدار نمونه ی اضافه شده به محیط

۱

۱

۱

تعداد مثبت در هر دسته

 

 

MPN در ۱۰۰ میلی لیتر ← 11 پس می توان نوشت:                    MPN=11

 

 

 در پلیت هایی که کلی فرم کشت داده بودیم ، کلونی ها رشد کرد و آنها را مشاهده کردیم.

 

pardisnews.com

محیط EMB

محیط BPLS

محیط VRBA

رنگ محیط کشت در پلیت

صورتی

زرد

صورتی

رنگ کلونی ها

سبز آبی با درخشش فلزی

زرد پر رنگ (پر رنگتر از محیط)

صورتی پر رنگ (پر رنگ تر از محیط)

 

 

پس بررسی ماکروسکوپی کلونی ها ، نوبت به بررسی میکروسکوپی آنها رسید. برای مشاهده باکتری های کلی فرم توسط میکروسکوپ از رنگ آمیزی گرم استفاده کردیم. مراحل انجام رنگ آمیزی گرم به شرح زیر است:

  1. تهیه گسترش : یک قطره سرم فیزیولوژی را یه وسیله آنس حلقوی روی لام قرار دادیم. آنس را استریل کردیم و از کلونی باکتری مقداری را برداشتیم و در قطره سرم حل کردیم. پس از آن قطره را مقداری پخش کردیم. این کار باعث می شود تا از تراکم باکتری ها در یک محل جلوگیری شود و در آخر مشاهده بهتری را داشته باشیم. لام را روی حرارت گرفتیم و آنرا تثبیت کردیم.
  2. اضافه کردن کریستال ویوله: روی گسترشی که تهیه کرده بودیم به مدت ۳۰ تا ۴۰ ثانیه کریستال ویوله ریختیم و آنرا با آب شستشو دادیم.
  3. اضافه کردن لوگل: لوگل را به مدت ۱ دقیقه روی آن ریختیم و با آب شستیم. در برخی از منابع موجود است که می توان به جای لوگل از ید استفاده کرد.
  4. شستشو با الکل – استون: این مرحله باید با دقت انجام شود و بیش از چند ثانیه نباید به طول انجامد(تا وقتی که آخرین قطره رنگ از روی لام خارج شود). اگر در این مرحله به زمان دقت نشود باعث می شود رنگ گرم مثبت ها در الکل حل شود و در آخر نشود گرم منفی را از مثبت تشخیص داد.
  5. اضافه کردن سافرانین: این ماده را به مدت ۴۰ ثانیه روی لام می ریزیم و بعد شستشو می دهیم.

اسلاید را زیر نور لامپ قرار دادیم تا خشک شود. پس از خشک شدن روی آن یک قطره روغن سدر ریختیم و با عدسی ۱۰۰ x مشاهده کردیم.

یک بار از روی محیط EMB  و یک بار از روی محیط VRBA اسلاید تهیه کردیم( هر کدام از اعضا گروه یک اسلاید درست کرد)

همانطور که در میکروسکوپ واضح بود ، باکتری ها گرم منفی بودند و میله ای شکل ، که به طور پراکنده در محیط قرار داشتند.

 

 

Leave a Reply 15666 views, 1 so far today |

Leave a Reply

Time limit is exhausted. Please reload the CAPTCHA.

1R8A94601R8A94661R8A93781R8A9319Ryan's Pub, St Julian, December 25, 2016Gorgeous Gorgs, Sliema, December 24, 2016The 11:40 Rogue One Show on Eden in St Julian, December 28, 2016Ariëlla 006Lu #XAriëlla 005