| Mobile | RSS

محیط کشت باکتری – قسمت اول

آذر ۱ام, ۱۳۸۹ | ۳ Comments | Posted in محیط کشت

محیط های متداول در کشت میکربی و نحوه تهیه آنها :

مقدمه :

برای مطالعه میکروارگانیسم ها باید بطریقی آنها را بر روی محیطهای مناسب از نظر شرایط فیزیکی و شیمیایی کشت داد . مطالعه زیاد درباره میکروارگانیسم ها و نحوه زندگی آنها باعث شده که تا کنون انواع زیادی از محیط کشت با ترکیبات متفاوت به طور مصنوعی برای استفاده در آزمایشگاههای میکروبیولوژی تهیه شود . هرچند انواع این محیط کشت ها زیاد می باشند، معهذا در مواردی برای کشت نوع بخصوصی از یک میکروارگانیسم باید از یک نوع محیط کشت بخصوص با ترکیبات مشخص استفاده شود.

بطور کلی محیط های کشت باید دارای مشخصات معینی باشند و هنگام تهیه و استفاده از محیط کشتها باید به نکات زیر توجه شود :

تمام محیط کشتها باید واجد مواد غذایی ضروری برای رشد میکروبها باشند
PH محیط کشت باید در حد معین قبل از استفاده برای کشت تنظیم شود.
ظروف مورد استفاده برای تهیه محیط کشتها باید کاملا تمیز و عاری از مواد خارجی باشند .
آب مقطر مورد استفاده باید بطریقه صحیح تهیه شود .
درجه حرارتی که برای استریل کردن محیط کشت مصرف می شود باید نسبت به نوع مواد غذایی مربوط در محیط کشت در نظر گرفته شود . درجات بالا باعث از بین رفتن برخی از مواد شیمیایی موجود در محیط کشت می شوند .

محیط های کشت باکتریها به سه صورت زیر تهیه میشود :

محیط کشت مایع یا آبگوشتی (liquid or broth media)
محیط کشت جامد (solid media)
محیط کشت نیمه جامد (semi solid media)

محیط کشت مایع ( براث ) :

این محیط فاقد آگار و فقط در لوله آزمایش یا فلاسک استفاده میشود . مثل محیط نوترینت براث.

محیط کشت جامد :

این محیط حاوی ۵/۱ تا ۲ درصد ماده آگار است که بعد از سرد شدن منعقد می شود . محیط کشت جامد را درون لوله آزمایش یا پلیت استفاده می کنند.مثل محیط TSI و M.c

دلیل بکارگیری محیط جامد ، تشخیص باکتریها به وسیله :

تشکیل کلنی
تولید پیگمانت
خصوصیات خاص هر کلنی
تشخیص انواع باکتریها که چند نوع باکتری در نمونه میکروبی وجود دارد .
موکوئیدی بودن باکتری
دیدن منطقه همولیز .

محیط کشت نیمه جامد :

این محیط در ترکیب خود مقدار کمی آگار دارد . بنابراین کاملا منعقد نمی شود و نیمه جامد باقی می ماند . مثل محیط SIM .

آگار :

ماده ای پلی ساکاریدی است که از یک نوع جلبک قرمز دریایی تهیه می شود، در c° 95 ذوب و در حرارت c° 42 منعقد می گردد .

محیط های کشت باکتری را از نظر نوع مواد تشکیل دهنده و از نظر کاربرد به چهار دسته تقسیم می کنند:

محیط کشت پایه (Basic Media) :
این محیط کمترین مقدار مواد غذایی برای رشد باکتریها را دارد . و مبنای تهیه انواع و اقسام محیطهای کشت می باشد . اکثر انواع باکتریها در آن رشد می کنند زیرا فاقد ماده ضد میکرب است . مانند محیط نوترینت آگار ، نوترینت براث .

محیط کشت غنی کننده (Enrichment Media) :
محیط مقوی بوده که دارای مواد تغذیه ای زیادی نظیر ویتامین ها ، لیپید ها ، اسید های آمینه برای رشد باکتری است . بنابراین تعداد زیادی از باکتریها روی آن بخوبی رشد می کنند . مانند شکلات آگار، بلادآگار .

محیط کشت افتراقی (Differential Media) :
محیط کشت تشخیصی بوده که کلنی باکتریهای مختلف روی آن کاملا از همدیگر متمایز می گردد. مانند محیط E.M.B ، M.c این محیطها دارای املاح صفراوی ، قند و معرف شیمیایی هستند که باکتریهای لاکتوز مثبت برروی آنها کلنی های صورتی رنگ و باکتریهای لاکتوز منفی نظیر سالمونلا ، شیگلا بر روی این محیط ها کلنی های سفید رنگ تشکیل می دهند . از محیطهای افتراقی دیگر محیط TSI ، سیمون سیترات را میتوان نام برد . این محیط ها برای رشد باکتریهای گرم – منفی روده ای (انتروباکتریاسه) مناسب هستند . چون وجود املاح صفراوی در محیط مانع از رشد باکتریهای گرم مثبت در محیط می شوند.

محیط کشت اختصاصی (Special Media) :
این محیطها برای رشد باکتریهای خاصی مناسبند . از این محیطها برای ایزوله نوع خاصی از باکتری در یک مخلوط میکربی استفاده می شود . مانند محیط s.s آگار که برای جدا کردن سالمونلا و شیگلا بکار میرود یا مانیتول سالت آگار که برای تشخیص گونه بیماریزای استافیلوکوکوس اورئوس استفاده می شود .

محیط کشت انتخابی : (Selective Media )
محیط هایی وجود دارند که دارای یک ماده مهار کننده رشد می باشند این مواد رشد تمام ارگانیسم ها بجز ارگانیسم مورد نظر را مهارمی کنند . درمرحله اول از رنگ هایی که دارای خواص ضد میکروبی هستند استفاده می شود ودر مرحله بعد استفاده از آنتی بیوتیک ها و مرحله آخر شامل وارد کردن مواد ترکیبی به محیط کشت جهت فعالیتهای متابولیکی ارگانیسم مورد نظر می باشد . از آنجا ئیکه این محیط ها جهت ارگانیسم مورد نظر انتخاب شده اند و برای سایر ارگانیسم ها مضر می باشند آنها را محیط های انتخابی می نامند . مثالی از این نوع محیط ها ، محیط کشت فنیل اتیل الکل آگار است که از رشد باسیل های گرم منفی هوازی و بی هوازی اختیاری ممانعت بعمل آورده و به ارگانیسم های گرم مثبت اجازه رشد می دهد .

طرز تهیه کلی محیط های کشت :

همانطوریکه می دانید محیطهای کشت به سه دسته جامد ، نیمه جامد ، مایع تقسیم می شوند . محیطهای مایع معمولاً فاقد آگار هستند یا مقدار آگارشان بسیار کم است . مثلاً حدود ( ۲/۰%) و محیط های نیمه جامد دارای مقدار کمی آگار حدود ۳- ۲ گرم وبالاخره محیط های جامد که دارای ۱۵- ۱۳ گرم آگار در لیتر محیط هستند .

برای ساختن محیط های کشت باکتری، ما از پودر مخصوص که در شیشه های مربوطه قرار دارد، استفاده می‌ کنیم. در روی این شیشه ها ترکیب محیط بطور کامل و همچنین طرز ساختن آن نوشته شده است . مثلاً برای ساختن نوترینت آگار ابتدا مقدار لازم از پودر آن را وزن کرده ودر مقدار معینی آب مقطر که قبلاً در یک ارلن مایر یا بطری ریخته اید اضافی نموده و آنرا کاملاً‌ حل نمائید وسپس با پنبه درب ارلن مایر را مسدود کرده و آن را روی سه پایه چراغ گازی حرارت می‌دهید ، تا زمان جوشیدن آنرا چند بار تکان دهید تا خوب حل شود و بمدت یک دقیقه بجوشد پس از آنکه مایع بجوش آمد ، آنرا برداشته وبا تکه کاغذ آلومینیومی روی پنبه را می‌پوشانید وظرف را در اتوکلاو می‌گذارید تا در فشار ۱۵ پاند بر اینچ مربع و حرارت ۱۲۱ درجه سانتیگراد به مدت ۱۵ دقیقه استریل شود . بعد از استریل کردن بگذارید تا خنک شود تا حدود c450- 40 . سپس در حالیکه ارلن را در دست راست گرفته و پنبه آنرا با دست چپ کنار شعله خارج کرده‌اید ، دهانه ارلن را یکبار از درون شعله گاز عبور دهید وبعد درون پلیت های استریل شده بین cc20- 15 از محل محلول بریزید . بعد پلیت ها را در کناری بگذارید تا سرد شوند وازتکان دادن آن خودداری نمائید وپس از جامد شدن محیطهای کشت نوترینت آگار را جمع کرده ودر c370 بمدت ۲۴ ساعت قرار دهید . اگر محیط ها آلوده نشده باشند آنها را از c370 بیرون آورده و در یخچال ۴ درجه سانتی گراد قرار می‌دهید .

طرز ساختن سایر محیطهای کشت، همینطور می‌باشد منتهی بعضی از محیطهای جامد در لوله مستقیم، پس از جوشاندن ریخته شده و بعد استریل می‌شوند که این محیطها را پس از استریل شدن، به طور ایستاده می‌گذاریم مثل محیط SIM و یا کج می‌گذاریم مثل محیط TSI تا سرد شوند .

برای ساختن محیط مایع (براث) پس از جوشاندن، محیط را در لوله‌ ها تقسیم می‌کنیم و سپس با پنبه‌ای درب آنها را مسدود کرده و جهت استریل داخل اتوکلاو قرار می‌دهیم .

انواع محیط های کشت

محیط های کشت عمده ‌ای که در آزمایشگاه مورد استفاده قرار می‌گیرند عبارتند از :

محیط نوترینت براث (Nutrient broth ):

این محیط مبنای ساخت اکثر محیطهای کشت است و از عصاره گوشت تهیه می‌شود طرز تهیه آن مثل نوترینت آگار می‌باشد . این محیط بدلیل نداشتن آگار بصورت مایع در لوله آزمایش تهیه می شود .

محیط نوترینت آگار (Nutrient agar):

چنانچه ماده آگار را به نسبت ۵/۱ تا ۲ درصد با آبگوشت غذایی مخلوط کنیم، این آگار غذایی بدست می‌آید . این محیط مبنای تهیه انواع و اقسام محیط های کشت جامد مثل Blood Agar , Chocolate agar می باشد .

محیط آگار خوندار (Blood agar) :

اغلب نمونه های رسیده به آزمایشگاه میکروب شناسی بر روی محیط آگار خوندار کشت داده می‌شوند، چون این محیط از رشد تمام واغلب باکتریهای سخت رشد حمایت کرده و اغلب میکروب شناسان عادت دارند بر اساس مورفولوژی کلنی بر روی آگار خوندار تصمیم گیری نمایند . این محیط از یک محیط پایه مانند تریپتون که منشاء پروتئینی دارد، کلرید سدیم آگار و ۵ درصد خون تشکیل شده است . برخی باکتریها آنزیم های خارج سلولی تولیدکرده که بر روی گلبول‌های قرمز عمل کرده و آنها راکاملاً لیز می‌کند (همولیزبتا ) یا یک تغییر سبز رنگ در اطراف کلنی ایجاد می‌کند ( همولیز ناقص یا آلفا ) در صورتی که برخی از باکتریها تغییری ایجاد نمی‌کنند ( همولیزگاما) تولید همولیزین بوسیله باکتری به بسیاری از فاکتورهای محیطی مانند PH ، اکسیژن و دما بستگی دارد. میکروب شناسان اغلب از مورفولوژی کلنی و تولید همولیزین به عنوان آزمایشات غربالگری اولیه جهت کمک به تصمیم در انتخاب مراحل دیگر جهت شناسایی یک باکتری استفاده می‌کنند. جهت مطالعه درست واکنش همولیتیک بر روی آگار خوندار، کارشناس بایستی پلیت را در مقابل نور گرفته و مشاهده نماید. اگر از لوپ جهت کشت خطی بر روی آگار خوندار استفاده می‌شود باید آنرا در آگار فرو برده ( Stabbing) تا ارگانیسم بتواند در زیر سطح محیط که اکسیژن کمتری دارد رشدکند . تولید همولیزین های حساس به اکسیژن در برخی از ارگانیسم ها بدین وسیله تشدید می‌گردد . به روش دیگر، می‌توان پلیت‌ها را جهت مشاهده واکنش همولیزین حساس به اکسیژن به طریق بی هوازی نیز انکوبه نمود.

طرز تهیه انواع محیط های کشت:

۱- ابتدا مقداری آب مقطر در داخل یک ارلن ریخته پودر نوترینت آگار را به آن اضافه و حل نمائید .

۲- محتویات ارلن را با آب مقطر به حجم برسانید .

۳- محتویات ارلن را روی شعله حرارت دهید تا بجوشد و محیط شفاف شود .

۴- محیط کشت را توسط اتوکلاو ۱۵ دقیقه درحرارت c 1210 استریل کنید .

۵- پس از استریل کردن، بگذارید تا حرارت محیط کشت به ۰c50- 45 برسد آنگاه در شرایط استریل ودر مجاورت شعله ، با توجه به حجم محیط ساخته شده، ۱۰ـ ۵ درصد خون گوسفند به آن اضافه نموده و خوب بهم بزنید تا کاملاً مخلوط شود .

۶- محیط را در مجاورت شعله داخل پتری دیش های استریل بریزید .

۷- پس از پخش محیط در داخل پلیت ها چنانچه در سطح آنها حبابهای هوا تشکیل شود، بااستفاده از شعله حبابها را از بین ببرید .

۸- ضخامت لایه آگار داخل پلیت ها نباید از ۴-۳ میلی متر تجاوز کند .

۹- پس از آماده و منجمد شدن محیط های ساخته شده، پلیت ها را به مدت ۲۴ ساعت در حرارت c370 انکوبه کنید . رشد باکتری بر روی این محیطهای کنترل ، نمایانگر آلوده بودن محیط ها است . بنابراین از این محیطهای آلوده نباید استفاده کرد .

محیط بلاد آگار در داخل یخچال به مدت یک هفته پایدار است و چنانچه بنحوی از تبخیر آب آن جلوگیری شود، پایداری آن بیشتر می‌شود .

محیط شکلات آگار(Chocolate agar):

در ساختن این محیط از محیط آگار استفاده می شود . پس از آماده نمودن و استریل کردن محیط پایه ، خون را هنگامی که هنوز داغ است ( در حدود ۰c85 ) به آن اضافه می کنیم .گلبولهای قرمز در این حالت لیز شده و محیط رنگ شکلاتی ـ قهوه ای به خود می‌گیرد . اکنون هموگلوبین و سایر مواد مغذی موجود در گلبولهای قرمز درمحیط وجود دارند . همین ( Hemin ) که فاکتور x خوانده می شود و کوآنزیم نیکوتین آدنین دی نوکلئوتید (NAD) که فاکتور V خوانده می‌شود ، به عنوان مکمل به محیط پایه آگار غنی از مواد مغذی اضافه می‌گردند . نایسریا گونوروه و گونه‌های هموفیلوس در میان سایر ارگانیسم های سخت رشد، رشد بهتری درحضور مواد مغذی مکمل اضافه شده به شکلات آگار دارند .

محیط ائوزین متیلن بلو (E.M.B) :

یک محیط افتراقی در بردارنده لاکتوز با پپتون وائوزین متیلن بلو است . رنگهای انیلینی موجود در محیط ( ائوزین ، متیلن بلو ) مانع از رشد باکتریهای گرم ـ مثبت می شوند .

این رنگها همچنین در PH اسیدی باهم ترکیب شده وایجاد رسوب می نمایند . بنابراین می توان از وجود آنها بعنوان شاخصی جهت تخمیر لاکتوز و تولید اسید نیز استفاده نمود .

باکتریها گرم ـ منفی بر اساس تخمیر یا عدم تخمیر قند لاکتوز کلنی های صورتی و یا بی رنگ تشکیل می دهند .

باکتری اشرشیا کلی ( E.coli ) که لاکتوز را بشدت تخمیر نموده و مقدار زیادی اسید تولید می نماید، بر روی این محیط دارای جلای فلزی سبزرنگ می باشد .

کلبسیلا، انتروباکتر، سراشیا که تخمیرکنندگان ضعیف لاکتوز هستند بر روی محیط کلنی های ارغوانی تولید می نمایند .

پروتئوس، سالمونلا، شیگلا که قادر به تخمیر لاکتوز نیستند بر روی این محیط کلنی های شفاف ایجاد می‌کنند .

محیط مک کانکی (Mac conkey agar) :

مک کانکی آگار معمولترین محیط کشت انتخابی ـ افتراقی بوده ودارای رنگ کریستال ـ ویوله جهت ممانعت از رشد باکتریهای گرم ـ مثبت و اندیکاتور قرمز خنثی (Nautral red) جهت نشان دادن خصوصیات افتراقی می باشد . با سیل های گرم ـ منفی به‌آسانی بر روی این محیط رشدنموده و باکتریهای تخمیر کننده لاکتوز ، محصولات اسیدی تولید نموده که سبب کاهش PH در محیط اطراف کلنی می گردد . اندیکاتور قرمز خنثی در PH اسیدی قرمز رنگ می‌شود . پس میکروارگانسیم های لاکتوز ـ منفی بی رنگ و شفاف مشاهده می شوند . مک کانکی آگار محیط انتخابی و افتراقی مورد استفاده جهت گونه‌های شیگلا می باشد .

طرز تهیه محیط E.M.B و M.C مثل تهیه محیط نوترینت آگار می‌باشد .

محیط سالمونلا ـ شیگلا (s.s) :

در محیط S.s ترکیباتی مانند پپتون ، لاکتوز ، املاح صفراوی ، نوترال رد، آگار، بریلین گرین ، تیو سولفات سدیم وجود دارد . این محیط فقط اجازه رشد به باکتری های سالمونلا و شیگلا را می دهد . بریلین گرین موجود در محیط مانع رشد باکتریهای گرم ـ مثبت و دیگر گرم منفی ها در محیط S.s می شود . با استفاده از این محیط می‌توان سوشهای تخمیر کننده لاکتوز را از سوشهایی که توانایی تخمیر لاکتوز را ندارند، تشخیص داد .

سالمونلا ، شیگلا قادر به تخمیر لاکتوز نبوده، درمحیط S.s کلنی های بی رنگ ایجاد می کنند که ارزش تشخیصی دارد .

طرز تهیه :

برای ساخت این محیط مقدار مورد نیاز پودر S.s را در آب مقطر ریخته و به حجم می رسانید آنگاه بوسیله جوشاندن پودر را در آب مقطر کاملاً حل می‌کنید . این محیط احتیاج به اتوکلاو ندارد .

محیط مانیتول سالت آگار (Mannitol salt agar)

یک محیط انتخابی به منظور جداسازی استافیلوکوکهای بیماریزا ( کوآگولازمثبت) از نمونه هایی که حاوی باکتریهای متعدد هستند بکار می رود

غلظت زیاد نمک ۵/۷% موجود در این محیط مانع از رشد کوکسیهای غیر بیماریزا می شود . پس از کشت باید محیط را در ۰C37 بمدت ۳۶ ساعت انکوبه کرد . تخمیر قند مانیتول توسط باکتری مورد آزمایش ، بوسیله معرف فنل ـ رد موجود در محیط مشخص می‌گردد . پس از انقضای مدت انکوباسیون ، استافیلوکوک های غیر بیماریزا بر روی این محیط ، کلنی های کوچک و سفید تشکیل می دهند که با هاله ای ارغوانی یا قرمز احاطه می شوند . در حالیکه کلنی استافیلوکوکهای بیماریزا زرد رنگ بوده و هاله زرد رنگی نیز آنها را احاطه می کند .

طرز تهیه :

۱- محیط را پس از حل کردن در آب مقطر به کمک حرارت مرطوب به مدت ۱۵ دقیقه توسط اتوکلاو استریل نمایید .

۲- پس از آنکه دمای محیط به ۰c50-45 رسید ، آنرا در پلیت های استریل تقسیم نمائید .

محیط سلنیت F و تتراتیونات (Selenit f and Tetrathhionate media)

این محیط غنی برای رشد سالمونلا بکار می رود و به باکتریهای کلی فرم اجازه رشد داده نمی‌شود . مقدار زیادی از نمونه مدفوع را به ۹ تا ۱۰ میلی لیتر این محیط می‌افزایند که به صورت مایع است . پس از ۲۴ ساعت انکوباسیون برای کشت دوباره محیطی مانند M.C و یا S.S آگار را بکار می برند .

محیط مولر هینتون (Muller-hinton.agar ) :

این محیط جهت انجام تست آنتی بیوگرام بکار می رود. این محیط همچنین قادر به فراهم آوردن شرایط رشد خانواده نایسریا نیز می باشد که در حالت اخیر ، باید محیط را پس از کشت نمونه مشکوک به نایسریا در فشار ۱۰- ۵ درصد CO2 انکوبه نمود .

طرز تهیه

۱- مقدار مورد نیاز پودر مولر هینتون را دریک ارلن حاوی آب مقطر ریخته و به حجم مورد نظر برسانید .

۲- با کمک حرارت ، پودر را در آب مقطر حل کنید تا محیط کاملاً شفاف شود .

۳- پس از مسدود کردن درب ارلن، محتویات آن را توسط اتوکلاو استریل نمائید .

۴- پس از آنکه حرارت محیط به ۰C 50 ـ ۴۰ رسید محیط را در شرایط استریل داخل پلیت ها تقسیم نمائید .

محیط تریپل شوگر آیرون ( TSI) :

این محیط بطور گسترده در تشخیص باکتریهای روده‌ای ( اعضای خانواده انتروباکتریاسه ) کاربرد دارد. که بصورت شیب دار در لوله آزمایش ساخته می شود و سطح بیشتری برای رشد باکتریها فراهم می‌آورد . کشت در محیط جامد بصورت عمقی ‌ـ‌ سطحی می‌گیرد .

محیط TSI حاوی معرف فنل ـ رد ، سولفات فرو ، تیو سولفات سدیم ( برای تشخیص تولید گاز سولفید هیدروژن ) و سه قند گلوگز ، لاکتوز و سوکروز است که غلظت گلوکز درمحیط ۱/۰ غلظت دو قند دیگر می باشد .

دامنه PH محیط از ۸/۶ تا ۴/۸ متغیر می باشد . این محیط قبل از کشت به دلیل داشتن معرف فنل ـ رد قرمز رنگ است .

با استفاده از TSI می توان سه خصوصیت را در یک باکتری مشخص نمود.

الف : توانایی تولید گاز CO2 , H2 از متابولیسم قندها .

ب : توانایی تولید مقادیر زیادی گاز سولفید هیدروژن که از طریق سیاه شدن محیط مشخص می شود .

( بی رنگ ) H2S تیوسولفات سدیم + محیط اسیدی ( باکتری )

(رسوب سیاه )FeS یون فریک + H2S

ج : توانایی تخمیر گلوکز ، لاکتوز و سوکروز .

باسیلهای گرم ـ منفی را بر اساس واکنش ایجاد شده بر روی این محیط می‌توان به پنج گروه تقسیم کرد :

در گروه I تخمیر گلوکز ، لاکتوز ، سوکروز ، منتهی به اسیدی شدن ( زرد شدن ) تمامی محیط و تولید گاز می‌گردد.

واکنش های ایجاد شده توسط باکتریهای گروه III,II همانند گروه I‌ است و تفاوت آنها فقط در تولید یا عدم تولید گاز است .

هنگامیکه عمق و سطح این محیط توسط باکتریهای گروه IV,III کشت داده می شود ، باکتری کشت داده شده ابتدا بطور هوازی و سپس بطریقه بی هوازی شروع به مصرف گلوکز می‌نماید . زمانی که هر دو طریقه در حال انجام است

( ساعات اولیه انکوباسیون ) PH‌ تمامی نقاط محیط کشت اسیدی و در نتیجه محیط زرد رنگ است اما از آنجایی که تخمیر هوازی در مقایسه با تخمیر بی هوازی با سرعت بیشتری بوقوع می‌پیوندد، گلوکز موجود در سطح به پایان رسیده و باکتریها شروع به تجزیه پپتون موجود در محیط می‌نمایند .از تجزیه پپتون در شرایط هوازی ، بی هوازی آمونیاک (NH3 ) تولید می‌شود . محصولات این عمل خاصیت قلیایی داشته و در نتیجه رنگ سطح محیط مجدداً قرمز می ‌شود . درهمین حال عمق محیط بدلیل سیر‌آرامتر تخمیر بی هوازی گلوکز، همچنان اسیدی و زرد رنگ باقی می‌ماند .

گروه V یا سیلهای گرم ـ منفی غیر تخمیر کننده مانند گونه های سودوموناس، پپتونهای موجود در محیط را تجزیه کرده ودر سطح و عمق محیط را بدون تولید گاز، قرمز رنگ می‌نمایند .

مطالب ذکر شده را می توان بصورت زیر خلاصه نمود :

گروه I سطح زرد / عمق زرد ، گاز مثبت ، H2S منفی.

گروه II سطح زرد / عمق زرد ، گاز مثبت ، H2S مثبت.

گروه III سطح قرمز / عمق زرد ، گاز مثبت ، H2S مثبت .

گروه IV سطح قرمز / عمق زرد ، گاز منفی ، H2S مثبت.

گروه V سطح قرمز / عمق قرمز ، گاز منفی ، H2S منفی

 

به طور خلاصه

محیط کشت آگار خوندار (Blood agar )

محیط کشت عمومی است که به منظور تکثیر و جدا سازی باکتری های بیماریزا بخصوص باکتری هایی که برای رشد به مواد مغذی نیاز دارند، بکار می رود. بعلاوه در این محیط وجود همولیزین در باکتری ها را نیز می توان کاوش کرد.

پس از اتوکلاو محیط پایه، هنگامی که درجه آن تا حدود ۵۰ درجه سانتیگراد رسید، خون دفیبرینه گاو را به نسبت ۵ تا ۷ درصد به آن اضافه نموده و با رعایت شرایط استریل در پلیت های استریل می ریزیم.

ممکن است بسته به نوع باکتری یکی از سه حالت ذیل مشاهده گردد:

۱- همولیز کامل β: باکتری واجد آنزیم همولیزین بوده و اطراف پرگنه منطقه شفافی ایجاد می گردد.

۲- همولیز ناقص α: باکتری واجد آنزیم همولیزین بوده ولی نسبت لیز کمتر از ۵۰ درصد می باشد و اطراف پرگنه هاله سبز رنگ ایجاد می گردد.

۳- عدم همولیزγ : باکتری فاقد آنزیم همولیزین می باشد.

محیط کشت آگار شکلاته (Chocolate agar)

اگر به محیط پایه آگار خوندار، هنگامی که درجه حرارت آن بعد از اتوکلاو در حدود ۸۰-۷۰ درجه سانتیگراد باشد، خون دفیبرینه گاو اضافه کنیم، محیط کشت آگار شکلاته بدست می آید. در این محیط بعلت اینکه گلبولهای قرمز خون در اثر حرارت متلاشی شده و اجزای آن خارج گشته، برای رشد باکتری هایی نظیر هموفیلوس و نایسریاها که نیاز بیشتری به مواد غذایی آماده دارند مناسب می باشد.

همانند محیط کشت آگار خوندار Blood agar بسته به نوع باکتری همولیز و یا همولیز ناقص و عدم همولیز ایجاد می گردد.

محیط کشت بریلیانت گرین آگار (Briliant green agar )

محیطی است انتخابی و برای جداسازی گونه های سالمونلا بکار می رود. این محیط از رشد بسیاری از باکتری های روده ای (انتروباکتریاسه) به جز سالمونلا جلوگیری می نماید. در صورتی که Ecoli، کلبسیلا و پروتئوس و سایر انترو باکتریاسه ها رشد نمایند، به دلیل اینکه قند لاکتوز و یا سوکروز و یا هر دو را تخمیر می نمایند و تولید اسید می کنند، در مجاورت معرف رنگی فنل رد به رنگ زرد در می آیند. در صورتی که باکتری های لاکتوز منفی مانند سالمونلا رشد نمایند، به دلیل عدم تخمیر قند در مجاورت معرف، محیط به رنگ ارغوانی در می آید.

محیط کشت مک کانکی آگار ((Macconkey agar

محیط انتخابی است که برای جداسازی و تعیین هویت باکتری های گرم منفی می باشد. املاح صفراوی و کریستال ویوله مانع از رشد باکتری های گرم مثبت می شوند. باکتری های تخمیر کننده ی لاکتوز (لاکتوز مثبت ها) کلنی هایی به رنگ ارغوانی و باکتری هایی که قادر به تخمیر نیستند (لاکتوز منفی ها) کلنی هایی بی رنگ ایجاد می نمایند.

رنگ ارغوانی کلنی های باکتری های لاکتوز مثبت مربوط به واکنش اسیدی است که در نتیجه تخمیر قند لاکتوز در مجاورت املاح صفراوی و جذب نوترال رد حاصل شده است.

معرف نوترال رد در محیط قلیایی بی رنگ و در محیط اسیدی قرمز رنگ است.

محیط کشت سابور دکستروز آگار (Saborad Dextrose agar )

محیط انتخابی برای تکثیر قارچها می باشد که بسیاری از باکتری ها نیز در این محیط رشد می کنند. انتخابی بودن این محیط برای قارچها بر اساس PH پایین و همچنین مواد غذایی ناچیز آن است.

محیط کشت DNASE

باکتری هایی که حاوی آنزیم دی اکسی ریبو نوکلئاز باشند، هاله صورتی رنگی اطراف کلنی ها پدید می آورند. تولوئیدن آبی در حضور DNA سالم به رنگ آبی است. ولی در صورت ریختن HCL ی نرمال موجب تخریب مولکول DNA شده و این ترکیب به رنگ صورتی در می آید.

محیط کشت مولر هینتون آگار ((Mueller hinton agar

کاربرد اصلی این محیط جهت تعیین حساسیت آنتی بیوتیکی باکتری ها (آنتی بیوگرام) به روش دیسک می باشد. بسیاری از باکتری هایی که سخت رشد Fastisious می باشند، نظیر Neisseria meningitides N.gonorrhoeae در آن رشد می یابند.

محیط کشت فلچر ((Flecher’s medium

این محیط برای جداسازی و نگهداری لپتوسپیراها بکار می رود. پس از استریلیزه کردن و خنک نمودن محیط، به آن ۸۰ میلی لیتر سرم خرگوش استریل اضافه نموده، سپس به مقدار ۷-۵ میلی لیتر در لوله های استریل ریخته به مدت ۳۰ دقیقه در حرارت ۵۶ درجه سانتیگراد قرار می دهیم تا عامل مکمل موجود در سرم غیر فعال گردد.

برای جداسازی لپتوسپیرا، نمونه های خون-ادرار و نسج مشکوک را در این محیط کشت داده و در حرارت ۲۹ درجه سانتیگراد به مدت ۳۰ روز انکوبه می نماییم. متناوبا از کشت گسترش تهیه کرده و بوسیله میکروسکوپ با زمینه تاریک کشت را کنترل می نماییم.

در اثر تکثیر لپتوسپراها کدورت جزئی در محیط به وجود می آورند که پیدایش یک حلقه شیری رنگ در قسمت بالای محیط می تواند حاکی از رشد لپتوسپرا باشد.

محیط کشت متیل رد – وژوسپروسکار Methylred-Vegesproskaure broth) MR-VP)

این محیط ملاک آزمایشی می باشد برای تفکیک مسیرهای تخمیر گلوکز و نهایتا ایجاد ترکیبات اسیدهای آلی بوتاندیول یا بوتیلن گلایکول بوده که از این آزمایش در تفکیک و تشخیص کلی فرم ها از هم مورد استفاده قرار می گیرد. همچنین در تمایز بین استافیلوکوک و میکروکوک و گونه های آن از این محیط استفاده می شود.

آزمایش MR: پس از انجام کشت و انکوباسیون ۳۷ درجه سانتیگراد به مدت ۴۸ ساعت، مقدار ۶/۰ میلی لیتر معرف رنگی متیل رد اضافه نموده و در صورت ظهور رنگ قرمز آزمایش MR مثبت می باشد. در صورت پیدایش رنگ نارنجی آزمایش MR مثبت ضعیف می باشد و در صورت عدم تغییر و پایداری رنگ زرد آزمایش MR منفی می باشد.

نتیجه:

ظهور رنگ قرمز: آزمایش مثبت (PH=4/4)

ظهور رنگ نارنجی: آزمایش مثبت ضعیف (PH=5/3)

ظهور رنگ زرد: آزمایش منفی (PH=5/3)

طرز تهیه معرف MR

۱- متیل رد ۰۴/۰ گرم

۲- اتانول ۴۰ میلی لیتر

۳- آب مقطر ۱۰۰ میلی لیتر

متیل رد را در اتانول حل نموده و به حجم ۱۰۰ میلی لیتر می رسانیم.

آزمایش VP: به لوله کشت داده شده و انکوبه شده حدود۶/۰ میلی لیتر معرف آلفا نفتول (معرف A) و مقدار ۲/۰ میلی لیتر محلول پتاس (معرف B) اضافه کرده و خوب تکان می دهیم. اگر تغییر رنگ صورت نگرفت آن را به مدت سی دقیقه به حال خود گذاشته و در صورتی که ظهور رنگ صورتی تا قرمز پدیدار شود، آزمایش VP مثبت و اگر تغییر رنگی صورت نپذیرد، آزمایش VP منفی خواهد بود.

نتیجه:

مثبت: ظهور رنگ صورتی تا قرمز

منفی: تغییر رنگی صورت نمی گیرد.

طرز تهیه معرف VP:

معرف A:

۱- آلفانفتول: ۵ گرم

۲- الکل اتلیک مطلق: ۱۰۰ میلی لیتر

محلول نباید تیره تر از رنگ کاه (نی) شود. در صورت لزوم باید مجددا تقطیر گردد.

معرف B:

۱- هیدروکسید پتاسیم: ۴۰ گرم

۲- آب مقطر: ۱۰۰ میلی لیتر

محیط کشت سلنیت F براث (Selenite F broth)

محیط مغذی است برای جدا سازی گونه های سالمونلاها. که یک محیط غنی کننده Enrichment می باشد که حاوی سلنیت سدیم است که یک نمک صفراوی است و مانع از رشد باکتری های گرم مثبت و بسیاری از باکتری های گرم منفی می گردد. میزان تکثیر سالمونلا در این محیط طی ۲۴-۱۲ ساعت اول از رشد هر یک از باکتری های روده ای سریعتر است. بنابر این کشت ثانوی باکتری در محیطهای دیگر باید ظرف همان روز (۲۴-۱۲ ساعت) انجام گردد.

باید توجه داشت این محیط در صورت ماندن و کهنه شدن خراب شده و رنگ آن به صورتی می گراید. بنابر این هرچه کم رنگتر باشد، تازه تر و برای کشت مناسبتر خواهد بود.

محیط کشت (Sulfide-Indol-Motility) SIM

با استفاده از این محیط سه خصوصیت مختلف باکتری را می توان سنجید و در تمام باکتری ها می توان بکار برد. به طریقه Stab تا یک سانتی متری انتهای لوله به وسیله آنس نوک تیز در این محیط کشت می دهیم.

اساس آزمایش:

مواد اولیه تولید اندول یعنی اسید آمینه تریپتوفان در پپتونهای محیط موجود است. هیدروژن سولفوره و سولفات نیز در محیط موجود است. قوام نیمه جامد بودن محیط نیز اجازه پخش شدن و در نتیجه کدر نمودن محیط را به باکتری های متحرک می دهد.

ایجاد هیدروژن سولفوره توسط باکتری به صورت سیاه شدن محیط ظاهر می گردد و در صورت متحرک بودن باکتری کشت شده، سیاهی نیز تمام محیطی که باکتری پخش گردیده است، انتشار می یابد. سیاه شدن محصول واکنش هیدروزن سولفوره تولید شده با سولفات آهن و تشکیل رسوب سولفوره آهن سیاه رنگ می باشد. با اضافه کردن یک میلی لیتر معرف کواکس Covacs و یک میلی لیتر کلروفرم به کشت ۲۴ ساعته، ظهور رنگ ارغوانی در سطح کشت دلیل بر تولید ایندول توسط باکتری است. باکتری های که حاوی مجموعه آنزیم هایی که اصطلاحا تریپتوفاناز نامیده می گردند، باشند، قادرند طی سری واکنشهای شیمیایی تریپتوفان را اکسیده و اندول استیک تولید نمایند.

حرکت باکتری بواسطه پخش شدن آن از مسیر خط کشت به اطراف و کدر نمودن محیط مشخص می گردد. باکتری های فاقد حرکت تنها مسیر خط کشت را که نمایان است، کدر می کنند. برای تعیین تولید اندول می توان از محیط تریپتوز نیز استفاده نمود.

روش آماده سازی معرف کواکس جهت تست اندول:

فسفو دی متیل آمینو بنزآلدئید: ۵ گرم

ایزو آمیل الکل: ۷۵ میلی لیتر

اسید کلریدریک: ۲۵ میلی لیتر

آلدئید را در الکل به آرامی حل نموده و از بنماری ۵۵-۵۰ درجه سانتیگراد استفاده نموده و به آن اسید اضافه رده و دور از نور و در ۴ درجه سانتیگراد نگهداری می نماییم. رنگ معرف باید از زرد روشن تا قهوهای روشن باشد. بعضی از نمونه ها آمیل الکل کافی نیست و با آلدئید رنگ سیاه می دهد.

محیط آبگوشت حاوی ۵/۶ درصد نمک ۶٫۵% (Nacl broth)

استرپتوکوک های روده ای را که غلظت زیاد نمک را تحمل می کنند، می توان به کمک این محیط از سایر استرپتوکوکها تشخیص داد.

تفسیر آزمایش:

از آنجا که تمام استرپتوکوک ها از تخمیر گلوکز اسید تولید می کنند در صورتی که این غلظت نمک را تحمل کنند و در این محیط رشد و تکثیر نمایند، از تخمیر گلوکز اسید تولید و محیط را به رنگ زرد در می آورند عدم تغییر رنگ دلیل بر عدم تحمل نمک و عدم تکثیر باکتری است.

نتیجه:

ظهور رنگ زرد: مثبت

بدون تغییر رنگ: منفی

محیط کشت لیزین دکربوکسیلاز (Lysine decarboxylase broth)

این محیط توان باکتری را در دکربوکسیله نمودن اسید آمینه لیزین ،تعیین می نماید. حاصل این واکنش تولید آلکالین آمین و کادوارین می باشد. به عنوان محیط تفریقی در تمایز بین آنتروباکتریاسه ها به کار برده می شود.

تفسیر آزمایش:از آنجا که همه آنتروباکتریاسه ها در نتیجه تخمیر قند گلوکز ،اسید تولید نموده و محیط را به رنگ زرد در می آورند ،محیط به رنگ زرد باقی خواهد ماند، مگر آنکه باکتری اسید آمینه مورد نظر را نیز دکربوکسیله کند. در این صورت قلیائیت حاصله، محیط به رنگ بنفش (قلیایی) در خواهد آمد.

نتیجه:

رنگ بنفش: مثبت

رنگ زرد: منفی

محیط کشت گزیلوز لیزین دزوکسی کولات آگار ( Xylose-lysin-decarboxycholate-agar) XLD

محیطی است انتخابی که از آن برای جدا سازی گونه های Shigella و سایر باکتری های پاتوژن روده ای بکار می رود.

کلی فرم ها و دیگر باکتری ها یی که قادر به تخمیر یک یا هر دو قند موجود در محیط باشند، کلنی هایی به رنگ زرد پدید می آورند.(اسید) تخمیر کننده های گزیلوز که لاکتوز و سوکروز منفی هستند مانند Proteus mirabilis واکنش اسیدی خفیفی (نارنجی-کهربایی) ایجاد می کنند. گونه ها Shigella که عموما هیچیک از این قندها را تخمیر نمی کنند، سرتاسر محیط لوله را به حالت قلیایی (قرمز تیره) در می آورند.

گونه های Salmonella اگر چه معمولا گزیلوز مثبت هستند، ولی به واسطه برتری داشتن دکربوکسیلاسیون لیزین بر اسیدیته تخمیر گزیلوز، محیط کاملا به رنگ قرمز (قلیایی) در می آید. کلنی های همه باکتری هایی که H2S تولید می کنند، بدون توجه به اسیدیته، مرکزی سیاه دارند.

محیط کشت برد پارکرآگار (Baird parker agar)

یک محیط (Medium) انتخابی است که حاوی تلوریت پتاسیم و تلوریت لیتیم می باشد. تلوریت محیط از رشد کلی فرم ها ممانعت می نماید. استافیلوکوک اورئوس می تواند تلوریت را به تلورید تبدیل نموده و باعث ایجاد کلنی های سیاه بر روی محیط گردد. زرده ی اضافه شده به محیط نیز باعث ایجاد دو واکنش در محیط می گردد. یکی تولید لسیتینازمنجر به ناحیه کدر و دیگری تولید لیپاز که منجر به ناحیه شفاف در اطراف ناحیه کدر می شود. در انتها کلنی های مشکوک به استافیلوکوک اورئوس باید تست کواگولاز انجام گردد.

محیط کشت اسکولین براث (Esculin broth)

محیط کشت تفریقی است که در تعیین هویت عده ای از باکتری ها مانند انترو باکتریاسه، اکتینوباسیلوس ها، از آن استفاده می شود.

بعضی از باکتری ها قادرند اسکولین را که نوعی گلیکوزید می باشد، هیدرولیز کرده و آن را به گلوکز، آگلایکن و آسکولتین تبدیل نمایند. در این فرآیند آهن موجود در محیط، واکنش نشان داده و ترکیبی به رنگ قهوه ای مایل به سیاه ایجاد می نماید. بنابراین تغییر رنگ محیط از زرد شفاف به سیاه و یا قهوه ای به معنی مثبت بودن آزمایش آسکولین می باشد.

محیط کشت آبگوشت نیترات (Nitrate broth)

از این محیط می توان در تعیین توان باکتری در احیای نیترات و تبدیل آن به نیتریت و مواد احیا شده دیگر بکار برد. بسیاری از باکتری ها را می توان از این جهت مورد آزمایش قرار داد، از جمله کورینه باکتری ها، باسیلوس ها و اکتینومایست ها و…

پس از کشت باید به مدت ۴۸ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد انکوبه نموده و پس از آن از هر یک از معرف های ذیل ۵ قطره به محیط اضافه نموده به طوریکه متوجه ظهور رنگ قرمز باشیم.

تفسیر آزمایش:

رنگ قرمز مربوط به پارا سولفور بنزن و آزونفتیل آمین می باشد، که نوعی رنگ آزو (Azo dye) است که در نتیجه دیازوتیازاسیون اسید سولفانیلیک به وسیله نیتریت و همچنین در اثر ترکیب نفتیل آمین با اتم انتهایی آزوتیازید، اسید سولفانیلیک حاصل می گردد. در صورتی که احیای نیترات از حد نیتریت هم گذشته و به مراحل تولید گاز ازت N2 یا آمونیاک۳ NH رسیده باشد، به علت عدم وجود نیتریت در محیط با افزودن معرف های ذیل تغییر رنگی ظاهر نمی شود. در حقیقت نتیجه آزمایش منفی کاذب است. به منظور تمایز منفی کاذب از منفی حقیقی، به محیط (پس از افزودن معرفها و منفی شدن) کمی پودر روی اضافه نموده، در صورتی که نیترات در محیط باقی مانده باشد یعنی باکتری آنرا به نیتریت تبدیل نکرده باشد، پودر روی، نیترات را به نیتریت احیا و رنگ قرمز ظاهر می گردد. عدم تغییر رنگ در این مرحله حاکی از عدم وجود نیترات در محیط است. این به آن معنی است که باکتری نیترات را از مرز نیتریت هم بیشتر احیا نموده و به گازهای ازت و آمونیاک تبدیل کرده است.

نتیجه پس از افزودن پودر روی:

۱- ظهور رنگ قرمز: نیترات منفی

۲- عدم تغییر رنگ: نیترات مثب

معرف تست نیتریت (Nitrit test reagent)

محلول (A)

اسید سولفانیلیک: ۸ گرم

اسید استیک (۵ نرمال): ۱ قسمت اسید استیک گلاسیال و ۵/۲ قسمت آب مقطر

محلول (B)

دی متیل ۱-آلفا-۱ نفتال آمین: ۵ گرم

اسید استیک (۵ نرمال): ۱۰۰۰ میلی لیتر

محیط کشت آگار انتخابی ویبریو Vibrio selective agar) TCBS agar)

آگار تیو سولفات سیترات بایل ساکارز جهت جداسازی و کشت انتخابی ویبریوها بکار می رود. غلظت بالای تیو سولفات و سیترات و قلیایی قوی این محیط رشد انتروباکتریاسه ها را تا حد زیادی متوقف می سازد. هر باکتری که بتواند در این محیط رشد کند، قادر به متابولیزه کردن ساکارز نمی باشد. فقط چند گونه ساکارز مثبت پروتئوس می توانند رشد نموده و کلنی های زرد مشابه ویبریو تولید نمایند. اندیکاتور مخلوط تیمول بلو-برومو تیمول بلو با تشکیل اسید به رنگ زرد تغییر رنگ می دهد. (حتی با وجودی که درجه قلیائیت آن بالاست)

محیط کشت کمپیلو باکتر سلکتیو آگار (Campylobacter Selective Agar Base)

از این محیط جهت جداسازی کمپیلو باکترها استفاده می گردد. در این محیط کشت که سرشار از مواد مغذی، اتمسفری با دی اکسید کربن کم و سرشار از دی اکسید کربن (Co2) مطمئنا کمپیلوباکتر بخوبی رشد یافته و آنتی بیوتیک هایی که به عنوان مکمل انتخابی کمپیلو باکتر به محیط اضافه می شوند تا حد زیادی رشد فلورای میکروبی را مهار می نماید. محیط انتخابی کمپیلو باکتر مخلوطی از سه آنتی بیوتیک متفاوت لیوفیلیزه می باشد. این مکمل رشد باکتری های همراه در طول کشت متوقف می سازد. هر ویال شامل ۲ میلی گرم وانکو مایسین، ۵ میکروگرم پلی میکسین و ۱ میلی گرم تریمتو پریم می باشد.

ماده لیوفلیزه را جهت تهیه آگار انتخابی کمپیلوباکتر به محیط کشت استریل که به دمای ۵۰-۴۰ درجه سانتیگراد رسیده اضافه می کنیم.

محیط کشت (Salmonella Shigella agar) SS

یک محیط انتخابی است که جهت تشخیص سالمونلا و شیگلا مورد استفاده قرار می گیرد. این محیط حاوی تیو سولفات سدیم بعنوان منبع گوگرد و آهن فریک به عنوان منبع آهن می باشد. همچنین حاوی لاکتوز و معرف نوترال رد می باشد. اگر باکتری تیوسولفات محیط را احیا کند، H2S تولید نموده که H2S با آهن موجود در محیط تولید پرگنه های سیاه رنگ می نماید. اکثر باکتری های لاکتوز مانند سالمونلا ها H2S مثبت میباشند.

محیط کشت (Orthonitro Phenul –β-D-galacto Pyramside) ONPG

با این محیط می توان وجود آنزیم بتا گالاکتوزیداز یعنی آنزیمی را که موجب شکستن مولکول لاکتوز می گردد را تعیین کرد. مهمترین کاربرد این آزمایش تعیین سریع لاکتوز مثبت های تاخیری در بین خانواده انترویاسه می باشد. باکتری هایی که دارای آنزیم بتا گالاکتوزیداز باشند، ONPG بی رنگ را سریعا شکسته و به د-گالاکتوز ارتونیتروفنل زرد رنگ تبدیل می نماید. اگر باکتری واجد هر دو آنزیم یعنی پرمه آز و بتا گالاکتو زیداز باشد، پس از ۲۴ ساعت لاکتوز مثبت است. اگر باکتری واجد یکی از دو آنزیم فوق باشد، پس از ۷۲ ساعت با تاخیر لاکتوز مثبت است و اگر هیچ یک از آنزیم ها را نداشه باشد، لاکتوز مثبت است.

محیط کشت فنیل آلانین د آمیناز Phenylalanine deaminase agar) PD)

با استفاده از این محیط می توان قدرت باکتری را در تولید فنیل پیروویک اسید از اسید آمینه فنیل آلانین را تعیین کرد. پس از یک شب انکوباسیون محیط چند قطره محلول ۱۰ درصد کلرور آهن را روی قسمت کشت شده محیط (سطح شیبدار محیط) ریخته ،در صورتی که واکنش دی آمیناسیون صورت گرفته باشد. با افزودن معرف، رنگ سبز ظاهر خواهد شد. این رنگ سبز نتیجه شلاته Chlate شدن فنیل پیرووات با یون آهن ایجاد یک ترکیب به رنگ سبز می باشد. در صورت پیدایش رنگ سبز تیره PD مثبت ودر بدون تغییر (زرد رنگ) PD منفی است.

محیط کشت سیمون سیترات آگار ((Simmons Citrate agar

برای تعیین قدرت باکتری در استفاده از سیترات به عنوان تنها عامل کربندار موجود در محیط میباشد. باکتری هایی که قادر به رشد در این محیط باشند در حقیقت توانسته اند از سیترات که تنها عامل کربن دار در محیط است استفاده کنند و در نتیجه در مجاورت معرف رنگی بروموتیمول بلو به رنگ آبی در می آیند.در غیر این صورت به علت عدم رشد باکتری و عدم تغییر رنگ محیط آزمایش سیترات منفی است.

محیط کشت سه قندی آهن دار TCI (Triple Sugar iron agar)

از این محیط جهت تعیین هویت باکتری های گرم منفی استفاده می شود. همچنین برای تعیین تولید H2S بکار می رود. این محیط دارای سه قند گلوکز، سوکروز و لاکتوز می باشد مقدار کمتر گلوکز در قیاس با دو قند دیگر تمایز باکتری ها را در تخمیر قندهای مختلف ممکن می سازد. آهن موجود در محیط گاز هیدروژن سولفوره ای را که از مواد گوگرد دار تولید می شود را به دام انداخته و مانع از خروج این گاز از محیط می شود. این واکنش به صورت رنگ سیاه که همان سولفور آهن است مشخص می گردد.گازی که در نتیجه تخمیرمواد قندی حاصل می شود به صورت حبابهایی در عمق محیط دیده می شوند و یا اینکه حجم گاز ممکن است زیاد بوده که در این صورت محیط آگار را به سمت بالای لوله رانده و فضای زیادی را اشغال می سازد.

نتایج تفسیر واکنشهای TSI

۱- در صورتی که هر دو قسمت شیب دار و ته لوله زرد شده و حباب تشکیل گشته، ولی سیاه نشده باشد، یعنی گلوکز، لاکتوز و سوکروز را تخمیر نموده و اسد تولید کرده و همچنین گاز نیز تولید نموده، ولی H2S تولید نشده است،acid/acid ، Gaz+ ،- H2S می باشد.

۲- در صورتی که ته لوله زرد و شیب لوله ارغوانی و گاز تولید و سیاه باشد، یعنی تنها قند گلوکز تخمیر شده و H2S نیز تولید شده است. Acid Alk/ ، Gaz+ ،+H2S می باشد.

۳- در صورتی که ته لوله زرد و شیب لوله ارغوانی و تولید و سیاه شده باشد، یعنی اینکه تنها گلوکز را تخمیرنموده و H2S تولید نشده است. Alk/Acid ، Gaz- ،- H2S می باشد.

۴- در صورتی که ته لوله و شیب لوله هر دو زرد و گاز متغیر باشد و ته لوله لوله نیز سیاه شده باشد، یعنی اینکه هر سه قند را تخمیر نموده و H2S نیز تولید نکرده است. acid/acid ، Gaz متغیر،+ H2S می باشد.

۵- در صورتی که سرتاسر لوله ارغوانی و سیاه نشده باشد، یعنی اینکه هیچ یک از قندها را تخمیر ننموده و H2S نیز تولید نکرده است. Alk/Alk ، Gaz- ،- H2S می باشد.

۶- در صورتی که سرتا سر لوله زرد و گاز و سیاهی در ته لوله متغیر باشد، یعنی اینکه هر سه قند را تخمیر نموده و تنها اسید تولید کرده، گاز و H2S تولید ننموده است. acid/acid ، Gaz- ،- H2S می باشد.

نکته: باید توجه داشت که نتایج کشت حداکثر طی ۲۴ ساعت پس از کشت قرائت گردد. چه بسا پس از این مدت ممکن است واکنش های اسیدی قسمت شیبدار تغییر یافته و قلیایی گردد. قسمتی از این تغییر واکنش اسیدی به قلیایی مربوط به این است که ذخیره کربوهیدرات های موجود در محیط تماما مصرف شده که در این صورت باکتری به مواد پپتون دار محیط رو می آورد و همچنین مقدار ناچیز اسیدی که در اثر تخمیر گلوکز حاصل شده به سرعت در مجاورت هوا (قسمت شیبدار) اکسید شده و ما حصل قلیایی است. در عمق لوله نیز به سبب فشار کم اکسیژن واکنش اسیدی حاصل از تخمیر قند گلوکز و همچنان اسیدی باقی می ماند.

محیط کشت ژلاتین Gelatin medium))

این محیط به منظور تعیین فعالیت پروتئولیتیکی باکتری ها می باشد. باکتری های پروتئولیتیک همیشه باکتری ها را ذوب می کنند. در صورتی که کشت ژلاتین در انکوباتور ۳۷ درجه سانتی گراد قرار داده شود، باید قبل از قرائت لوله های حاوی کشت ژلاتین را در دمای یخچال ۴ درجه به مدت ۱۵ دقیقه قرار داده، در صورتی که باکتری آنزیم ژلاتیناز را داشته باشد، لوله های کشت ژلاتین پس از انکوباسیون در یخچال به صورت مایع خواهند بود. در غیر اینصورت باکتری فاقد آنزیم ژلاتیناز می باشد.

توجه: نقطه ذوب محیط ژلاتین ۳۰-۲۰ درجه سانتی گراد می باشد.

محیط کشت (Oxidative Fermentative) OF

با کشت باکتری در این محیط می توان مشخص نمود که استفاده باکتری از کربوهیدرات از طریق اکسیداسیون یا از طریق تخمیر صورت کرفته است. این محیط را در دو قسمت، یکی حاوی پارافین و دیگری فاقد پارافین تهیه نموده و از نمونه در هر دو محیط کشت می دهیم. در صورتی که باکتری تنها از طریق اکسیداسیون قند را مورد استفاده قرار دهد، تنها در لوله فاقد پارافین، قند را مصرف کرده و محیط را اسیدی نموده، که در مجاورت معرف بروموتیمول بلو به رنگ زرد در می آید. رنگ زرد از بالای لوله شروع می شودکه باکتری از طریق فرمنتاتیو قندها را تخمیر نماید، هر دو لوله کشت (حاوی پارافین و فاقد پارافین) بر اثر تولید اسید شاهد ظهور رنگ زرد خواهیم بود. از محیط OF می توان در تمایز کوکسی های گرم مثبت بخصوص استافیلوکوک اورئوس استفاده نمود.

تست اکسیدازOxidase test) )

قطره معرف اکسیداز (محلول آبی تترامتیل-فسفات-فنیل آلانیل دی هیدروکلراید) را روی یک کاغذ صافی در یک پلیت قرار داده (قطرات روی کاغذ صافی خشک شوند) و میکروب مورد آزمایش را با یک سیم پلاتینیومPlatinium wire برداشته و آن را روی کاغذ آغشته به معرف اکسیداز گسترانیده و واکنش مثبت در مدت ۱۰ ثانیه بصورت ایجاد رنگ سیاه مایل به صورتی مشاهده می گردد.

آزمایش کواگولاز (Coagulase test)

با استفاده از این آزمایش می توان وجود آنزیم کواگولاز در باکتری استافیلوکوک اورئوس را مشخص نمود. آنزیم کواگولاز آنزیمی است که باعث لخته شدن پلاسمای سیتراته خرگوش می شود. با توجه به اینکه سیترات ماده ضد انعقاد می باشد، اما کواگولاز می تواند حتی در حضور ماده ضد انعقاد، پلاسما را لخته نماید. (فیبرینوژن را به فیبرین تبدیل نماید.)

تست کاتالاز (Catalase test)

با استفاده از این تست می توان وجود آنزیم کاتالاز را در باکتری مشخص نمود. در صورتی که باکتری واجد آنزیم کاتالاز باشد، با اضافه کرن آب اکسیژنه به کلنی برداشته شده باکتری بر روی لام، واکنش انجام شده به صورت تولید آب و اکسیژن بوده که به صورت حباب هایی نمایان می گردد. در صورتی که باکتری فاقد آنزیم کاتالاز باشد، بعد از اضافه نمودن آب اکسیژنه، هیچ گونه تغییری در تولید حباب حاصل از تجزیه آب اکسیژنه به آب و اکسیژن ایجاد نمی گردد و در نهایت باکتری کاتالاز منفی می باشد.

محیط کشت ائوزین متیلن بلو Eosin methylen-blue lactose sucrose agar) EMB)

این محیط فاقد املاح صفراوی می باشد و بیشتر برای باکتری های گرم منفی رودهای مناسب می باشد. باکتری Ecoliدر این محیط در حضور ائوزین متیلن بلو ایجاد جلای سبز فلزی می نماید، که کلید تشخیصی باکتری Ecoli نسبت به سایر باکتری های روده ایی می باشد.

محیط کشت Cookeedmeet

این محیط کشت به دلیل داشتن پارافین، باعث رشد باکتری های بی هوازی می گردد. این محیط کشت محیطی مغذی و غنی برای باکتری های بی هوازی مانند کلستریدیوم است. این محیط معرف خاصی نداشته و هدف ایجاد محیط کشت مناسب برای باکتری های بی هوازی است. بعد از رشد باکتری برای تفریق باید بر روی محیط های افتراقی با شرایط بی هوازی جهت تشخیص باکتری مورد نظر پرداخت.

 

و….

  

xylose lysine deoxycholate, brillient green agar, deoxy cholate citrate agar, bismuth fulfite agar, thiosulfate citrate bille sucrose, sugar, axidative fermetative, nitrate test, test catalase, test oxidase, ortho nitro phenyl B-galactoside, lysine decarboxylase, phenyl alanine deaminase, urease, esculin, Na-hippurat(sodium hippurate, IMVIC, gelatine, starch, Dnase, coagulase, litmus milke

 

Leave a Reply 89817 views, 20 so far today |
Follow Discussion

۳ Responses to “محیط کشت باکتری – قسمت اول”

  1. emo Says:

    this post is great haha i am bookmarking your blog man

  2. CNA Training Says:

    Finally, an issue that I am passionate about. I have looked for information of this caliber for the last several hours. Your site is greatly appreciated.

  3. mostafa Says:

    HELLO
    This section is very great
    can you tell me there are for each bacterial culture separately(with name)?

Leave a Reply

Time limit is exhausted. Please reload the CAPTCHA.

Coffee Time!warm greetingsYuWT3P6466WT3P6569WT3P6542WT3P6425Proud LonelinessIt's complicatedMithlond